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文章信息 题目：Improved Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation using antibiotics and acetosyringone selection in cucumber 刊名：Plant Biotechnology Reports 作者：Changxia Du, Huaifu Fan et al. 单位：Zhejiang A&F University  01 摘要 黄瓜（Cucumis sativus）是世界上最重要的蔬菜作物之一。由于黄瓜的常规育种非常具有挑战性，基因工程是引入重要性状的替代选择，例如增强的抗逆性和营养价值。然而，转化系统的效率取决于基因型、转化条件等。本研究旨在优化农杆菌介导的黄瓜转化的转化参数。我国北方广受欢迎的典型黄瓜品种'新泰密刺’进行农杆菌GV3101转化。该菌株携带 pCAMBIA2300s 质粒，这是一种含有标记基因新霉素磷酸转移酶 II ( npt II) 的二元载体。结果表明，头孢噻肟钠适用于在筛选和芽伸长阶段抑制农杆菌生长。Timentin 最好在生根阶段使用。此外，在筛选早期使用25 mg/L卡那霉素，并增加到50 mg/L进行进一步筛选。在芽伸长和生根阶段，分别使用75和100 mg/L卡那霉素，以提高筛选效率。为了获得最高的抗性芽再生频率，分别在预培养基、感染溶液和共培养基中加入 50、150 和 100 μM 乙酰丁香酮。为了确认转基因的存在，来自npt II的 DNA在移植抗性再生植物后，通过PCR分析转化的黄瓜植物。我们最终实现了 8.1% 的转化效率，这是迄今为止使用黄瓜品种“新泰密刺”报道的最高效率之一。 02 技术路线
03 主要结果 3.1 卡那霉素对外植体再生频率和褐变的影响 将未转化的外植体置于具有不同卡那霉素浓度的培养基中 28 天（图 1-a）。随着卡那霉素浓度的增加，芽的再生频率和褐变水平呈现相反的趋势。0 mg/L处理的再生频率为90.0%，显着高于任何其他处理。在 25、75 和 100 mg/L 处理之间观察到显着差异。然而，50、75 和 100 mg/L 处理的再生频率没有显着差异。褐变在 50 mg/L 处理时开始出现，在 100 mg/L 处理时达到峰值 (90.0%)。除100 mg/L处理外，其他处理无明显差异（图1-b）
3.2 抑菌抗生素对农杆菌和外植体的影响 外植体在含有 300 mg/L 头孢噻肟钠、羧苄青霉素或替门汀的选择性培养基中培养 28 天（图 2-a）。实验结果表明，300 mg/L的三种抗生素均能抑制农杆菌在外植体上的生长。头孢噻肟钠治疗的耐药芽发生频率最高（76.7%），与替莫丁治疗的差异水平相同。羧苄青霉素处理的耐药芽频率最低（43.3%），与替莫丁处理无显着差异（图 2-b）。图 2 的 c 部分显示了农杆菌在不同类型抗生素上的生长。当培养时间达到96 h时，用替门汀处理（6.4 cm）观察到抑菌圈的最大直径。相比之下，用羧苄青霉素处理的最低（5.6 cm）。在所有处理中都看到了显着差异。另一个有趣的发现是，在 30 天的培养时间，观察到抑制区的最大直径 (5.8 cm) 响应于特美汀治疗。此外，结果与替门汀和头孢噻肟钠处理相似。然而，羧苄青霉素处理的抑菌圈直径显着减小并随着时间的推移达到最低水平（4.4 cm）（图2-d）。在另一个实验中，未感染的外植体与不同浓度的头孢噻肟一起培养 28 天（图 2-e）。随着头孢噻肟钠浓度的增加，每个外植体的再生芽数从7.1个减少到2.7个，减少了近4倍。与0 mg/L处理相比，100 mg/L处理并没有显着改变再生芽的数量。0 和 100 mg/L 处理的再生芽数显着高于任何其他处理。200、300 和 400 mg/L 处理之间没有显着差异（图 2-f）。
3.3 乙酰丁香酮对抗性芽再生的影响 在遗传转化的四个重要阶段添加不同浓度的乙酰丁香酮：预培养（图 3-a）、感染（图 3-b）、共培养（图 3-c）和选择性培养（图 3）。3-d) 阶段。28天后统计抗性芽的再生频率，描述如下。在预培养阶段添加乙酰丁香酮的试验中，随着乙酰丁香酮浓度的增加，抗性芽的频率先升高后降低。50 μM 处理产生最高频率的抗性芽 (53.3%)，显着高于 100、200 和 400 μM 处理所观察到的。然而，大于或等于 100 μM 的乙酰丁香酮处理显示出对抗性芽频率的严重抑制。0 和 50 μM 处理之间没有显着差异（图 3-e）。如图 3-f 所示，在农杆菌接种过程中，随着乙酰苯胺浓度的增加，抗性芽的最终频率先增加后减少。抗性芽的再生频率在150 μM处理下达到峰值（53.3%），显着低于200 μM处理（20.0%）。除 150 μM 处理外，其他处理之间未发现显着差异。由图3-g可知，随着共培养阶段乙酰丁香酮浓度的增加，抗性芽的出现先增加后减少。100 μM 处理产生的抗性芽再生频率最高（80.0%），与 50 μM 和 200 μM 处理的差异相同，显着高于 0 和 400 μM 处理。0和400 μM处理获得的抗性芽再生频率最低（33.3%），与50和200 μM处理相比无明显差异。外植体在添加了乙酰丁香酮的筛选培养基中生长，结果如图 3-h 所示。随着乙酰丁香酮浓度从 0 增加到 200 μM，抗性芽的频率从 53.3% 下降到 23.3%。0、50和100 μM处理下抗性芽的频率表现出相同程度的差异，而50、100、150和200 μM处理具有另一个差异水平。综上所述，这些结果表明额外的乙酰丁香酮可以在转化的早期增加抗性芽的再生频率，但在筛选后不会（图 3）。
3.4 聚合酶链式反应 (PCR) 分析 培育再生黄瓜植株，从第9嫩叶中提取总DNA。报告基因 npt II 的引物用于鉴定转化植物（图 4-a），扩增出 480 bp 的产物，与阳性对照相同。农杆菌基因组的引物用于消除农杆菌对植物的污染，除泳道 12、17 和 18 外，再生植物的总 DNA 未扩增（图 4-b）。野生型植物和阴性对照的 DNA 没有扩增（图 4）。
 04 总结 此处报道的转化方法是在以往黄瓜报道的基础上进行了修改和改进的方案。本研究采用农杆菌转化法，主要步骤如图 5 所示。我们使用真空系统增加了浸染深度，并设置了卡那霉素的梯度浓度以防止对嫩植物的损害以及假阳性和嵌合植物的出现。我们在不同阶段使用了三种抗菌抗生素，并比较了它们对农杆菌GV3101和外植体生长的影响。通过在重要的遗传转化阶段选择和使用乙酰环丙酮，我们提高了抗性芽的再生频率。改良遗传转化系统应用3个月后，成功从黄瓜'新泰密刺’的子叶节获得转化植株（图5）。从223个外植体中再生出134个抗性芽，获得42个生根再生植株。最后，18株植物被鉴定为阳性。阳性率为42.8%，转化效率为8.1%，与其他报道相比有所提高（Wang et al. 2013）。该项目旨在改进与'新泰密刺’遗传背景相似的黄瓜农杆菌介导转化，为其他基因型转化工作奠定基础。
05 获取原文 原文PDF下载： https://www./h-nd-101.html#_np=107_423的附件 END 06 广告 |
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