Exploring urine sediments as a non-invasive method for DNA methylation detection in bladder cancer Cite this article El azzouzi, M., El ahanidi, H., Hafidi Alaoui, C. et al. Exploring urine sediments as a non-invasive method for DNA methylation detection in bladder cancer. Afr J Urol 28, 31 (2022). https:///10.1186/s12301-022-00298-3
探索尿沉渣作为膀胱癌 DNA 甲基化检测的非侵入性方法
背景 膀胱癌变过程中发生的主要表观遗传事件是 DNA 甲基化，影响参与各种代谢途径和细胞调节的基因。使用诸如尿沉渣之类的生物液体可以作为一种非侵入性方法来增强膀胱癌的管理。在这项研究中，我们旨在确定膀胱癌中一组基因在肿瘤活检和尿液沉积物中的启动子甲基化状态，以评估尿液样本作为甲基化状态评估的非侵入性方法的有用性。 方法 使用甲基化特异性 PCR 技术，我们探索了摩洛哥膀胱癌患者的 40 例肿瘤活检及其配对尿液样本中 hTERT 、 TWIST1 、 VIM 和 NID2基因的启动子甲基化状态。 结果 在本研究中，膀胱肿瘤在TWIST1、hTERT、NID2 和 VIM 基因中显示单个基因的启动子高甲基化频率分别为 90%、85%、62.5% 和 72.5% 。 有趣的是，尿样甲基化检测的特异性为100%，检测 TWIST1 、 hTERT 、 NID2 和 VIM 基因高甲基化的灵敏度达到91.7%；97.1%；分别为 84% 和 82.8%。 结论 我们的结果清楚地表明，尿样中启动子高甲基化的评估具有高度特异性和高灵敏度。此外，尿沉渣将是检测基因 DNA 甲基化状态及其与膀胱癌发展的潜在关联的有用方法。 背景 全球膀胱癌 (BC) 是第 10 位最常见的癌症，每年约有 570,000 例新病例和超过 210,000 例死亡 [ 1 ]。目前，BC 的诊断和随访方式是膀胱镜检查和尿细胞学检查；膀胱镜检查对大多数肿瘤高度敏感，但它可能无法识别较小且扁平的肿瘤，例如原位癌。此外，它是一种昂贵且侵入性的程序，显示出不足以准确预测患者结果的能力。相反，尿细胞学检查是一种无创性和高度特异性的检查方式，但对低级别和高分化病变的敏感性较差 [ 2 ]。因此，需要其他具有高灵敏度和特异性的非侵入性、快速和准确的替代方案来改善 BC 管理。近年来，人们进行了广泛的努力来确定 BC 的分子特征，以改善患者的治疗和预后预测。在这种情况下，据报道，许多表观遗传变化与癌症的恶性和进展有关。膀胱癌发生过程中发生的主要表观遗传事件是 DNA 甲基化。它影响参与各种代谢途径和细胞调节的基因 [ 3 ]。此外，使用尿沉渣等生物液体作为膀胱癌检测和监测的非侵入性方法引起了广泛关注。因此，几项研究表明，尿液是检测膀胱癌各个阶段和级别的分子变化的可靠基质 [ 4 ]，并可用作一种非侵入性方法来识别分子特征以增强膀胱癌管理。在这个光学中，本研究计划评估一组已知参与膀胱癌发生、肿瘤活检及其配对尿液沉积物的基因的启动子甲基化状态，以评估尿液样本作为非侵入性方法的有用性启动子甲基化检测和膀胱癌管理。 方法 标本 在摩洛哥拉巴特大学军事医院泌尿外科通过经尿道膀胱切除术或膀胱镜检查获得了总共 40 个新鲜冷冻肿瘤样本，并在手术前从每位患者身上获得了配对的尿液样本。该研究的方案得到了摩洛哥拉巴特医学和药学院生物医学研究伦理委员会的批准（参考文献 82/19），并获得了每位招募患者的书面知情同意书。 甲基化特异性 PCR (MSP) 组织标本立即储存在 - 80 °C。通过在 4500 g 下离心 15 分钟将排尿的尿液（50 mL 新鲜尿液）离心，将沉淀的尿液沉淀物用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次并在 - 80 °C 下储存。 使用苯酚/氯仿法 [ 6 ]从新鲜肿瘤活检和尿细胞沉积物中提取基因组 DNA 。然后，从每个样品中提取的 500 ng 基因组 DNA 用于亚硫酸氢盐修饰，如前所述 [ 7 ]。通过 EZ DNA 甲基化试剂盒（Zymo Research，USA）进行亚硫酸氢钠修饰和 DNA 纯化。使用一组基因“ TWIST1 , hTERT 、 VIM 和 NID2 ” [ 8、9、10、11 ]。_ _ _ _ 扩增反应在最终体积为 25 µl 中进行，其中包含 2 µl 修饰 DNA、1X PCR 缓冲液、1.5 mM MgCl 2 、10 µM 每种 dNTP、10 µM 每种引物和 1U Platinum Taq 聚合酶（Invitrogen，美国） . 混合物首先在 95 °C 下变性 10 分钟。然后，进行 40 个循环的 PCR，在 95°C 下变性 30 s，引物在相应温度下退火 45 s（表1) 和引物在 72 °C 下延伸 45 秒。在循环结束时，混合物在 72°C 下孵育 10 分钟。每个反应都包括一个阴性对照，其中 DNA 从扩增混合物中省略。通过在 2% 琼脂糖凝胶上电泳分析 PCR 产物，然后用溴化乙锭 (10 mg/ml) 染色。敏感性反映了在相同基因启动子的匹配肿瘤 DNA 甲基化病例中尿液 DNA 甲基化的患者比例。特异性反映了在相同基因启动子的匹配尿液 DNA 中显示甲基化的病例中甲基化肿瘤活检的数量。 统计分析 使用 IBM SPSS 软件版本 23 的百分比和 95% 的置信区间 (CI) 对肿瘤活检和尿沉渣中基因启动子的高甲基化状态进行统计评估。 结果 肿瘤标本的临床病理学特征总结在表 2 中。患者的平均年龄为 67 岁，范围为 47 至 84 岁。招募最多的病例分期≤ PT1，肿瘤分级高（表 2 ）。 在所有患者的肿瘤活检和匹配的尿沉渣中评估了启动子的甲基化，结果总结在表 3 中。在全球范围内，至少在一个研究基因的所有膀胱肿瘤活检中都发现了 DNA 高甲基化。膀胱活检和配对尿沉渣中研究基因的高甲基化比较表明，所有尿沉渣 DNA 高甲基化的病例在膀胱活检的相应 DNA 中都有异常甲基化；表明尿沉渣中甲基化检测的特异性为 100%。 在本研究中，尿沉渣中高甲基化检测的灵敏度因研究基因而异。 hTERT 97.1% [95% CI = 77.5–98.2] 较高，VIM 基因 82.8% [95% CI = 64.2–94.2] 较低（表 3 ）。 讨论 肿瘤学研究的最新进展表明，肿瘤的分子特征是癌症分层、个性化治疗和可靠预后的关键因素 [ 12 ]。肿瘤的分子特征主要基于对导致基因激活/失活和细胞通路失调的基因改变的评估。在过去十年中，人们对作为与癌症发展和进展相关的主要表观遗传事件的 DNA 甲基化变化产生了极大的兴趣 [ 13 ]。在膀胱癌中，DNA 高甲基化已被用作检测和诊断临床标本（如组织活检和尿沉渣）中肿瘤细胞的靶标 [ 4 ]。在这项研究中，我们使用 MSP 分析来评估摩洛哥膀胱癌患者的肿瘤活检和尿沉渣 DNA 中一组基因的启动子甲基化状态。兴趣集中在 TWIST1、hTERT、NID2 和 VIM 基因上，因为它们在许多细胞途径中的意义以及它们作为膀胱癌中高度甲基化基因的广泛报道数据 [ 14 , 15 , 16 , 17 ]。 在本研究中，膀胱肿瘤在TWIST1、hTERT、NID2 和 VIM 基因中显示单个基因的启动子高甲基化频率分别为 90%、85%、62.5% 和 72.5% 。这些发现与已经报道的摩洛哥患者数据非常一致 [ 17 ]。有趣的是，Leão 等人报道了 BC 中 TERT的中频 (53%) 和 TWIST1 (98%) 启动子的高频甲基化。[ 14 ] 和 Yegin 等人。[ 16 ]，分别。每个基因启动子的甲基化研究扩展到所有研究患者的匹配尿沉渣 DNA。总体而言，在 39 个分析样本中检测到至少一个基因的启动子高甲基化；从而尿液中甲基化的检测覆盖率达到97.5% [95% CI = 86.8-99.9]。有趣的是，尿液样本中 TWIST1 和 TERT启动子高甲基化检测的敏感性更高； 分别达到 91.7% 和 97.1%。Yegin 等人支持这些结果。（2013）和芬奇等人。（2011 年），谁表明 TWIST1 和 TERT 高甲基化对尿液沉积物中膀胱癌的检测具有高灵敏度（分别为 87.5% 和 76%）和特异性（分别为 93.3% 和 100%）。 16、18 ] 。_ Renard 等人 报道了类似的结果。（2010 年）已经确定了尿液沉积物中 TWIST1 甲基化检测的高灵敏度和特异性（分别为 90% 和 93%）。在本研究中，检测尿沉渣中 NID2 和 VIM 高甲基化的灵敏度分别为 84% 和 82.8%。这些结果与 Yegin 等人报道的结果略有不同。（2013）和科斯塔等人。(2010)，显示膀胱癌患者的敏感性频率更高（分别为 95.8% 和 96%）[ 16 , 20 ]。这种差异可能是由于我们研究中的队列较小。科学证据表明，尿液 DNA 可能是从膀胱壁的原始原发肿瘤或肿瘤病变中脱落的，因此尿液沉积物中的遗传和表观遗传改变将反映膀胱肿瘤组织的整体情况。此外，尿沉渣中的 DNA 甲基化评估对临床医生和患者具有很大的潜在附加价值：（1）一种非侵入性方法；(2) 减少膀胱癌诊断和监测所需的膀胱镜检查次数，以及 (3) 节省时间和预算。 在这项研究中，特别令人感兴趣的是，所有研究的基因都获得了 100% 的特异性。事实上，甲基化仅在肿瘤组织也显示基因启动子甲基化的患者中检测到，因此没有检测到假阳性结果，对所有研究的基因具有 100% 的特异性。这些结果引起了人们的极大兴趣，并突出了使用尿沉渣进行生物标志物评估的兴趣。 这项研究提供了非常丰富的信息，并清楚地强调了尿沉渣作为一种有价值的非侵入性基质用于表观遗传学研究的有用性。然而，由于使用了仅识别 DNA 甲基化的定性水平的 MSP 技术以及我们研究队列的小规模，因此存在一些限制。需要对大量人群进行进一步的研究以确认所获得的结果。结论 我们的研究清楚地表明，非侵入性尿液样本中启动子的高甲基化评估具有高度特异性，显示出极大的敏感性，并且将是研究表观遗传改变及其与膀胱癌发展的潜在关联的有用方法。
