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文章信息 题目：Editing melon eIF4E associates with virus resistance and male sterility 刊名：Plant Biotechnology Journal 作者：Miguel A. Aranda et al. 单位：Centro de Edafología y Biología Aplicada del Segura (CEBAS)-CSIC 日期：01 July 2022  01 摘要 帽结合蛋白质 eIF4E 通过与 eIF4G 的相互作用构成 eIF4F 复合物的，在 mRNA 的环化及其随后的5'帽依赖性翻译中起关键作用。除了它在 mRNA 翻译起始中的基本作用外，还具有其他功能，包括充当前病毒因子和参与性别发育。我们使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑来生成甜瓜eif4e敲除突变系。编辑系统在甜瓜中可以有效工作，因为我们已经在 T0 代第一个eIF4E中获得了纯合单核苷酸缺失的转化植物。用西瓜花叶病毒（MWMV）接种分离F2代的编辑和非转基因植物；纯合突变植物表现出病毒抗性，而杂合和非突变植物被感染，这与我们之前在eIF4E中沉默的植物的结果一致。有趣的是，T0 和 F2 代的所有纯合编辑植物都显示出雄性不育表型，而与野生型植物杂交恢复了生育力，突变株雄性不育表型的分离与eif4e的分离之间有完美相关性。对连续发育阶段的甜瓜雄花的形态学比较分析表明，小孢子母细胞和绒毡层的减数分裂后发育异常，突变体与野生型绒毡层降解的时间存在明显差异。RNA-Seq 分析确定了在eif4e/eif4e植物花中下调的花粉发育关键基因，并表明 eIF4E 特异性 mRNA 翻译起始是甜瓜雄性配子形成的限制因素。 02 技术路线
03 主要结果 3.1 四种甜瓜基因型的再生转化效率 甜瓜器官发生高度依赖于基因型，之前的研究评价了四个甜瓜种质的再生能力。不同种质的再生芽数量存在显着差异（P < 0.05），M2 和M5 种质平均每个外植体分别产生1.7 和2 个芽。所有四个种质都显示出很高的再生能力，尤其是 M2 和 M5，它们显示出外植体率，至少有一个再生芽高于其他种质（图 S1）。我们接下来使用荧光标记 DsRed 来评估四种甜瓜种质的转化效率（表 1）。在所有检查的种质的外植体中检测到大的 DsRed 表达，在 M5、C46 和 M9 中观察到更丰富的表达。然而，这三个种质产生的生根系数量较少，与 M2 相比，这导致转化效率较低（表 1）（图 S1）。因此，我们选择了具有最高转化效率 (3%) 的 M2 用于 CRISPR/Cas9 构建体的转化实验。
3.2 CmeIF4E CRISPR/Cas9 介导的基因编辑 在甜瓜基因组中，eIF4E (MELO3C002698.2) 和eIFiso4E (MELO3C023037.2) 分别编码 eIF4E（235 个氨基酸）和 eIFiso4E（203 个氨基酸），共享 61% 的编码核苷酸和 52% 的氨基酸。gRNA1 旨在靶向eIF4E的第一个外显子（图 1a），与eIFiso4E没有序列同源性。通过农杆菌介导的转化产生三个独立的转基因T0系。对于两个选定的系，靶向区域的 PCR 扩增子测序显示 PAM 序列上游的三个核苷酸纯合子的单核苷酸缺失（图 1b); 这种突变在编辑位点下游产生了一个提前的终止密码子（图 1c）。
为了测试突变的遗传力，并使编辑后的品系永久化，我们使编辑后的 T0 植物适应体外条件，并在温室中将它们培育成苗。在开花期，我们检测到eif4e敲除突变体中缺乏花粉，使得自交不可能。尽管如此，雌雄同体花的雌性生殖器官似乎是有功能的。因此，我们将eif4e / eif4e T0 植物和eIF4E / eIF4E WT 植物杂交以获得 F1 代（图 S2a）。转基因（带有 Cas9 转基因）与F1 种群的 14 株植物中的非转基因（没有 Cas9 转基因）植物的比例约为 1:1，正如预期的单个转基因插入基因组（图 S2b）。对转基因和非转基因植物的 PCR 扩增子进行了测序。所有非转基因植物都表现出与 T0 中相同的单核苷酸缺失，但是处在杂合状态。这些结果表明，甜瓜中诱导的突变可以通过种系稳定传播。在两株转基因植物中，色谱图显示两个等位基因都存在单核苷酸缺失，这可能表明 gRNA1 和 Cas9 仍然活跃，并且能够在受精后编辑 WT 等位基因。所有剩余的转基因植物对于eIF4E中的突变都是杂合的（图 S2c）。转基因和非转基因植物都被转移到温室中并生长成熟进行种子繁殖。在开花期，我们检查了每个个体的表型：所有杂合突变体（转基因和非转基因）都显示出完全可育和正常的生长表型。 为了获得 F2 代，我们专门使用从非转基因 F1 个体的自花授粉获得的种子。虽然我们播下了 350 粒种子，但我们只能获得 283 株 F2 植物。每株植物的基因分型表明，F2 后代分离为纯合突变体 ( eif4e / eif4e )、杂合子 ( eIF4E / eif4e ) 和纯合 WT ( eIF4E / eIF4E )（图 S3）。通过使用 CRISPR-P 体系 将 gRNA1 序列与瓜基因组作图来评估潜在的脱靶。确定了五个潜在的脱靶位点（表 S1）。扩增子测序和人工检查替代靶标的 RNA-seq 数据（见下文）均揭示了非转基因 F2 编辑植物中的 WT 序列（数据未显示）。 3.3 CmeIF4E与植物对 MWMV 的抗性有关 我们之前已经证明转基因 RNAi eIF4E沉默的甜瓜植物表现出广泛的病毒抗性，包括对马铃薯病毒 MWMV 的抗性。为了验证敲除eIF4E是否赋予甜瓜病毒抗性，来自上述 F2 后代 ( n = 283) 的所有幼苗均用 MWMV 接种。幼苗在 10 dpi 开始出现花叶症状，在杂合和 WT 植物中在 14 dpi 左右变成严重的叶片变形（图 2a）。在 20、30 或 40 dpi 时，在任何纯合突变植物中均未检测到任何症状。
在 21 dpi，我们确定了从每组（纯合突变体、杂合和纯合 WT）中随机抽取的五株植物中的病毒载量。在纯合突变植物中未检测到 MWMV RNA，而在杂合和 WT 植物中检测到可变但显着的病毒载量。在这个实验中，我们引入了 RNAi eIF4E沉默的甜瓜系作为对照植物，正如预期的那样，没有病毒积累（图 2b）。
对来自 F2 的18株 eif4e/eif4e植物进行了 6 个月的观察。有趣的是，接种 4 个月后，在 18 株植物中的两株中观察到与 MWMV 感染相符的症状，表明发生了抗性降低事件。为了验证症状是否是由 MWMV 引起的，对两株受影响植物的有症状的幼叶进行取样，并进行 RT-qPCR 以确定 MWMV 的存在。有症状的植物 MWMV 检测呈阳性；因此，回接种试验（图 2c) 用于确认抗性破坏 (RB) MWMV 分离株的存在：我们用来自表现出晚期症状的抗性植物的汁液接种了六株 WT 和六株 RNAi 植物，并用原始接种物接种了另外六株 WT 和六株 RNAi 植物。14 dpi 后，两种接种源接种的 WT 植物均出现症状，但只有从晚期感染植物制备的接种物中的分离物能够感染 RNAi 瓜系，克服了抗性；我们将把这种分离株称为 MWMV-RB。
使用从用两种来源接种的植物的全身感染叶片中提取的 RNA 确定单个植物中病毒载量的 RT-qPCR 分析证实 MWMV-RB 能够克服由eIF4E诱导的抗性沉默。MWMV-RB 似乎在沉默的植物中积累较少（图 2d）。我们通过 RT-PCR 扩增了整个VPg顺反子并对 DNA 产物进行了测序。序列比对显示，在 MWMV-RB 分离物中，单核苷酸取代导致单个氨基酸变化 N163Y（图 2e) 。为了进一步了解 eIF4E 和病毒 VPg 之间的相互作用，我们模拟了这两种蛋白质之间的相互作用，该模型表明该残留物不位于 eIF4E 和 VPg 之间的接触面上（图 2f）。相比之下，来自不同马铃薯病毒的 VPgs 的多序列比对表明，氨基酸 163 嵌入两个保守基序中，而且萝卜花叶病毒 (TuMV) RB 分离株具有等效的替代物来克服抗性（图 2e；S4）。
3.4 比较 WT 和eif4e敲除突变体植物中雄性花发育的结构分析 如上所述，纯合突变体 T0 植物表现出雄性不育，而与 WT 杂交恢复了 F1 个体的生育力。F2显示雄性不育表型的分离与eIF4E突变的分离之间存在完美的相关性。纯合隐性突变植物在 1-5 天后抽薹，它们的花比杂合和 WT 植物的花瓣更小、更浅。突变花药小而白，无成熟花粉粒，不开裂，导致完全雄性不育（图 3）。
为了确定花粉发育过程中的结构差异，检查了来自 WT 和eif4e突变植物的不同发育阶段的花药的纵向和横向半薄切片。至于其他葫芦科植物，从雄蕊原基的形成，到花药开裂时成熟花粉的释放，雄瓜花的发育可分为12个阶段。与第 9 阶段之前的 WT 相比，突变植物的花药结构未检测到显着差异（数据未显示）。因此，从第 9 阶段开始进行花药发育的比较分析（图 4）。在第9阶段，WT花药原基分化成同心圆结构，小孢子母细胞（图4中标记为Ms）在小孢子母细胞（图 4中标记为Ms ）被一个四层花药壁包裹，从表皮的表面到内部，内皮，中间层和绒毡层（图 4a）。小孢子母细胞随后经历减数分裂，在第 10 阶段结束时产生一个四分体。同时，绒毡层细胞经历了它们的程序性细胞死亡 (PCD)（图 4c），直到它们完全降解（图 4g）。相反，在eif4e的微分过程中突变雄花，花药壁和小孢子均表现出异常发育：花药和花室通常尺寸较小，并且含有较少数量的小孢子母细胞（图 4b）。WT 中的小孢子母细胞的特征是多面体形态，具有高度浓缩的染色质核，并被高度组织化的绒毡层细胞包围（图 4a）。相反，在突变体中，观察到形状更圆的小孢子母细胞，被绒毡层包围，绒毡层具有更多杂乱和更小的细胞（图 4b）。在四分体阶段，花粉发育的结构差异变得更加明显：在WT中，四分体明显形成，并且在切片中可以观察到四分体的四个细胞中的至少三个（图 4c）。在突变体中，小孢子母细胞似乎经历了不完全的减数分裂和小孢子个体化，因为该阶段的花药似乎包含大部分处于二分体阶段的细胞（图 4d）。虽然在减数分裂后可以观察到一些小孢子细胞在突变体中，但与野生型的圆形相比，它们的结构以某种方式坍塌（比较图 4e，f）。在第 10 和第 11 阶段之间开始出现 WT 和突变花药之间的显着区别：具有圆形的正常空泡小孢子沿绒毡层均匀分布，与 WT 中的外壁相对应的深色花粉壁（图 4e，g ); 相比之下，突变体花药的内腔变得杂乱无章，而不是像 WT 那样在花药室内随机分布花粉粒，突变体中塌陷的花粉粒粘附在非结构化的深色材料上，这可能对应于内部不完全退化的绒毡层。小室壁（图 4h）。
晚期突变体的花药腔充满大量深色物质（图 5a-d)，这可能来源于绒毡层分泌的孢粉素液滴。在第 12 阶段，成熟花粉在 WT 植物中呈深色染色，花粉粒看起来结构良好，表明 WT 花粉粒是有活力的（图 4i；5e 和 g；S5a和 c）。相比之下，突变花药在第 12 阶段的花药中显示出小孢子和其他未知来源的染色/深色物质的非结构化聚集（图 4j；5f、h；S5 b 和 d)。
3.5 RNA-seq 分析比较 WT 和eif4e敲除突变体植物的雄性花发育 我们在花发育过程中比较了 WT 和突变雄花的转录组的四个阶段：花结构形成 (FS) 阶段，当雄花和雌雄花尚未分化且花蕾长度小于 2 毫米时；当花蕾大小为 2-5 毫米时；配子成熟 (GM) 阶段，和当花蕾大于 2 厘米时。因此，我们收集了八组花，分别命名为 FS/FSmut、GI-M/GI-Mmut、GM-M/GM-Mmut 和 AN-M/AN-Mmut。每个生物重复收集 50 个花蕾，每组制备三个重复。RNA-seq reads被映射到甜瓜参考基因组。对于所有比较，将reads计数标准化为FPKM，以获得基因表达的相对水平。如果每个样本的三个生物学重复中的 FPKM 值高于 1，则认为基因已表达。因此，表达约14 500 个基因（图6a）。层次聚类分析表明，生物复制的基因表达模式高度相关（图 S6）。所有生物学重复的 PCA 显示 WT 和突变体之间的基因表达模式明显分离，在 WT 和突变体中的花发育事件中基因表达模式的明显分离（图 6b）。
FSmut与FS、GI-Mmut与GI-M、GM-Mmut与GM-M 以及 AN-Mmut与AN-M 的比较分别提供了 1649、1162、2490 和 2096 个 DEG，其中 GM-Mmut与GM- M 是发现最多 DEG 的比较（图 6c）。对所有 DEG 进行了 GO 富集分析。FS 中的 DEG 富含“质体”、“光合作用”、“核糖体”、“翻译”和“叶绿体”等（图 7a）。GI 中的 DEG 在“MCM 复合物”、“酶抑制剂活性”和“光系统”类别中富集（图 7a）。GM中最具代表性的 GO 类别是“膜”、“代谢过程”、“rRNA 结合”、“细胞壁”、“催化活性”、“果胶分解代谢过程”、“转运蛋白活性”、“细胞外区域” '、'跨膜转运蛋白活性'和'细胞氨基酸生物合成过程'（图 7a）。
 04 结论 在这项研究中，我们使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑来生成甜瓜eif4e敲除突变甜瓜系。我们获得的三个突变系在纯合子中已经从 T0 代中具有相同的一个核苷酸缺失，而没有识别出替代目标的编辑。通过将突变纯合的转基因系与具有相同遗传背景的 WT 系杂交，我们能够获得 F1 代，包括大约一半的非转基因个体，它们呈现与 T0 相同的单一缺失，但处于杂合状态。这些结果表明，转基因插入发生在杂合体中，并且很可能在T0植物中是单一的，并且另外证明了在甜瓜中诱导的突变可以通过种系稳定地传递。因此，CRISPR/Cas 编辑似乎在甜瓜中效果很好，但再生和遗传转化仍然是主要限制。我们的研究结果表明，除雄性不育外， eif4e敲除植物的生长表型也会降低。 05 原文获取 原文链接：https://onlinelibrary./doi/10.1111/pbi.13885?af=R END 06 广告 |
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