来源:生物世界 2022-08-16 17:49 该首次通过引入启动子改造HR-donor开发出了转录偶联新型基因编辑器TEd。通过一系列优化,TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大片段knockin效率低的问题。 CRISPR-Cas系统介导的“基因编辑”前沿生物技术的开发与应用已引起了全世界的广泛关注,各种各样依赖于HR同源重组途径的基因编辑器已经能够实现DNA的精准插入或基因敲除,这不仅促进了生物医学的基础研究,同时为多种遗传疾病的治疗带来了巨大的临床应用前景。然而哺乳类动物细胞中对于长片段DNA(尤其是10kb以上)的精准插入(或删除)效率却非常低,这严重阻碍了CRISRP技术在大片段基因编辑时的操作可行性。 上海科技大学生命学院高冠军团队在 Nucleic Acids Research 期刊在线发表题为:Transcription-coupled donor DNA expression increases homologous recombination for efficient genome editing 的研究论文。 团队随后基于上述发现设计开发了一系列优化的TEd基因编辑系统,通过在同源供体DNA上引入启动子以形成TC-donor(Transcription-Coupled HR-donor),并在其转录产物TC-RNA的3’端添加多个MS2茎环结构以及在Cas9上融合MS2适配体的结合结构域(MCP),团队发现优化后的TEd系统在几种哺乳类细胞中的编辑效率相比于传统CRISPR-Cas9介导的编辑方法(CEd)均有更大幅度的提高(TEd方法对于GFP的精准插入可以达到传统方法CEd的10倍左右),并在高达10kb的DNA片段敲入方面也获得了很好的效果(传统CEd方法对于5kb片段靶向插入已非常困难)。不过,TEd方法的应用还受限于其TC-donor的转录方向。研究发现,TC-donor的转录方向对TEd编辑效率具有重要影响,仅当TC-donor的转录产物互补于对应gRNA的非靶向链时,TEd介导的基因编辑效率才相比经典CEd方法具有显著效率提升,这提醒研究者在后续实际应用中应当注意TEd系统的整体设计。 总而言之,该首次通过引入启动子改造HR-donor开发出了转录偶联新型基因编辑器TEd。通过一系列优化,TEd初步解决了传统CRISPR-Cas9介导的同源重组在大片段knockin效率低的问题。此外,TEd方法对于基因删除、取代、点突变较传统方法都有显著提高,这为TEd将来在临床治疗方面的应用奠定了基础。同时,团队大胆预测TEd转录偶联编辑器可能同样适用于其它物种。 |
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