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——背景介绍—— 热休克蛋白90 (HSP90) 在人类疾病中，如神经退行性疾病与癌症的发生中起到重要作用。多种靶向 HSP90的抑制剂已经开发出来，并已进入人体临床试验。2019年2月19日，上海有机化学研究所潘鹤龄课题组与哈佛大学医学院袁均瑛教授课题组在PNAS上发表题为“Chaperone-mediated autophagy is involved in the execution of ferroptosis”的研究论文，揭示了一个由HSP90介导的调节细胞坏死与铁死亡的机制，首次从机制上建立了这两种细胞死亡方式的联系。此外，该研究也证明了蛋白伴侣介导的自噬参与了铁死亡的发生。 ——研究结果—— 在这项研究中，研究人员确定了一种已知的抑制HSP90的化合物——CDDO，作为细胞坏死的抑制剂，也可以抑制铁死亡。首先，研究人员用约600种已知生物活性的化合物库对诱导坏死的HT-22细胞系进行筛选，确定了CDDO浓度依赖性地抑制HT-22细胞坏死,EC50为10μM。接下来研究了CDDO对其他细胞死亡形式的影响，发现CDDO也能抑制由Erastin诱导的铁死亡。
图一 CDDO抑制细胞坏死与铁死亡 研究中发现CDDO抑制了HT-22 和HT-29细胞坏死过程中S166–RIPK1, RIPK3 和 MLKL 的磷酸化，抑制了HT-22细胞中RIPK1和RIPK3的相互作用，这些结果表明CDDO抑制RIPK1激酶的活化，进而阻断复合物IIb的形成以及RIPK3和MLKL的磷酸化。 为了探讨CDDO抑制铁死亡的机制，研究人员分析了CDDO对铁死亡生物标志物的影响，包括活性氧积累、脂质过氧化和GPX4降解。在CDDO存在的情况下，Erastin诱导的铁死亡中的活性氧被显著抑制，也发现CDDO抑制丙二醛(脂质过氧化的最终产物)的产生。这些结果表明CDDO在脂质过氧化的上游起作用。GPX4是脂质过氧化的关键抑制剂，用铁死亡诱导剂如erastin和谷氨酸盐处理HT-22细胞导致GPX4蛋白水平降低，而CDDO可以抑制这一过程。然而，CDDO不能抑制GPX4直接敲除引起的铁死亡，也不能抑制由GPX4的共价抑制剂RSL3诱导的铁死亡，同时，CDDO对GPX4的转录水平也没有影响。这表明CDDO通过保持活性GPX4的生理水平来保护细胞免受铁死亡。
图二 CDDO通过阻断GPX4降解抑制铁死亡 CDDO已被证明能抑制多种蛋白质，包括PPAR-γ, ErbB2,Akt, STATs, Keap1,和HSP90。研究人员直接用这些蛋白的抑制剂来检验其与细胞坏死和铁死亡的相关性。只有HSP90抑制剂tanespimycin对细胞坏死和铁死亡都有抑制作用。提示HSP90可能是CDDO阻断坏死和铁死亡的共同调控节点。 为了研究HSP90调节GPX4降解的机制，研究人员使用了几种不同类型蛋白质降解抑制剂，包括蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂，发现只有溶酶体途径抑制剂能抑制谷氨酸盐或Erastin诱导的铁死亡和GPX4降解。通过质谱分析GPX4的结合蛋白发现，在与GPX4结合的蛋白质中，Erastin处理后，热休克同源蛋白 (HSC70) 和HSP90的水平都增加了。使用免疫共沉淀证实了HSC70和HSP90的相互作用和GPX4与HSC70的相互作用。此外也发现在用Erastin处理的细胞中，HSC70和HSP90的相互作用增加，而CDDO降低了这种相互作用。 已知HSC70与Lamp-2a有关，研究人员发现敲除Lamp-2a和HSC70显著降低了铁死亡，并恢复了用Erastin处理的细胞中GPX4蛋白的水平。由于溶酶体中的蛋白伴侣介导的蛋白质降解需要Lamp-2a和HSC70，这些结果与溶酶体抑制剂抑制谷氨酸盐或Erastin诱导的GPX4降解一致。
图三 铁死亡中GPX4通过蛋白伴侣介导的降解 已知HSC70能识别底物并与底物结合以递送至溶酶体膜，而Lamp-2a作为受体将底物递送至溶酶体基质中进行降解。研究人员发现Erastin、谷氨酸盐和RSL3诱导的铁死亡都导致不同细胞系中Lamp-2a水平的增加，并且Lamp-2a的增加被CDDO所抑制。Erastin处理后，GPX4和HSC70或Lamp-2a之间的相互作用显著增加。通常，HSC70识别和结合含有KEFRQ样序列的底物，事实上，GPX4含有几个与HSC70识别序列一致的五肽序列(124NVKFD128,169LIDKN173和187QVIEK191)。为了从功能上确定GPX4中这些序列对其在铁死亡过程中降解的重要性，研究人员在上述序列中产生了具有2-aa突变的GPX4突变体，并发现带有突变序列的GPX4对Erastin诱导的降解表现出抗性。由于Lamp-2a水平的增加可能会促进蛋白伴侣介导的自噬，研究人员测试了在铁死亡过程中其他蛋白伴侣介导的自噬的底物的降解水平，发现GAPDH的蛋白水平，一种已确立蛋白伴侣介导的自噬底物，在Erastin诱导的铁死亡细胞中也降低了。此外，用CDDO处理显著恢复了GAPDH的蛋白质水平。综上，研究人员得出结论，铁死亡的激活导致Lamp-2a水平的增加，从而促进蛋白伴侣介导的自噬，进而介导多个底物的降解，包括GPX4。因此，蛋白伴侣介导的自噬的激活参与了铁死亡。 ——小结—— 这项研究揭示了一个由HSP90介导的调节细胞坏死与铁死亡的机制，HSP90的抑制可能导致RIPK1的构象变化，从而导致激酶活性的抑制，最终抑制了细胞坏死。同时也通过影响蛋白伴侣介导的自噬过程抑制了GPX4蛋白的降解，从而抑制了铁死亡。 参考文献： Wu Zheming, et al."Chaperone-mediated autophagy is involved in theexecution of ferroptosis." Proc Natl Acad Sci USA, 116(2019): 2996-3005. DOI: 10.1073/pnas.1819728116 作者：由瀚天 |
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