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——背景—— 单颗粒冷冻电镜（Cryo-EM）的快速发展使得解析分子量大于300kDa生物大分子的近原子分辨率的三维结构变得更加可行。然而，使用单颗粒冷冻电镜解析小分子量尤其是小于100kDa生物大分子的高分辨率结构仍是一个挑战。2017年德国马普所Danev研究组解析出的分子量为64KDa的 3.2Å人源血红素的三维结构以及2019年美国Lander课题组解析的同样为64kDa的高铁血红蛋白的2.8Å三维结构，是在本文之前利用冷冻电镜解析出的原子分辨率级别的最小分子量的生物分子。 ——文章亮点—— 来自清华大学的王宏伟课题组与其合作课题组在2019年6月3日于《Nature Communications》在线发表文章“Single particle cryo-EM reconstruction of 52 kDa streptavidin at 3.2 Angstrom resolution”，该研究利用球差校正器和电压相位板联用冷冻电镜成像系统以及使用单层大单晶石墨烯载网的冷冻样品制备技术，解析了52kDa链霉亲和素蛋白（SA）的3.2Å分辨率结，创造了利用单颗粒冷冻电镜技术解析的近原子分辨率的生物大分子的最小分子量记录。
图1. 3.3Å Apo-SA 和3.2Å Biotin-SA的三维结构 同时，本文通过结合电子断层成像技术和相关的数据处理方法，鉴定了来自气液界面的颗粒和吸附在石墨烯表面的颗粒，并研究了不同分布颗粒对分辨率的贡献，研究结果认为气液界面会对蛋白颗粒造成结构上的影响，这也为多年来的“气液界面破坏蛋白颗粒结构”的理论落下了“实锤”。 ——技术亮点—— 亮点1：该研究团队利用球差矫正器和电压相位板耦联的冷冻电镜成像系统，进行了数据的采集。 近年来，许多硬件开发已经被引入到冷冻电镜的电子光学设备，例如能量过滤器（energy filter）、球差矫正器（Cs-corrector）和电压相位板（Volta phase plate, VPP）等，可以进一步提高成像质量。比如，电压相位板（VPP）可以为物镜的对比度传递函数（CTF）引入额外的相移，从而增加弱相物体的低频信号，例如冷冻水合的生物分子，可以显著提高蛋白颗粒在图像中的衬度以提高颗粒识别和挑选的效率，同时又可以保留高分辨信息用于后期三维重构，因此在小蛋白结构解析上有较好的表现，被结构生物学家青睐。
图2. （a）利用球差矫正器和电压相位板耦联的冷冻电镜成像系统获得的图像; （b）对应颗粒的二维类平均 亮点2：利用北京大学彭海琳课题组制备的大单晶石墨烯载网进行样品制备和成像。 研究团队发现具有单层碳原子的单晶石墨烯为样品引入了非常低的背景噪声，并且还可以作为评估冷冻电镜图像质量和运动校正及其六边形晶格信号的良好参考。还发现石墨烯薄膜可以作为良好的支撑材料，使SA蛋白颗粒保持多个方向，以进行高分辨率的结构测定。 ——结果亮点—— 亮点1：最大的亮点当然是“利用冷冻电镜解析分子量最小的近原子分辨率的生物大分子结构” 。 亮点2：解析了Biotin-SA（配体结合）的原子分辨率结构，可以识别结合蛋白质和配体的结合口袋和可能的相互作用。同时，单颗粒分析技术对于样品异质性的配体占据和构象表现的分类能力可以在无需结晶的条件下加速药物的筛选，表现了在基于结构的药物筛选方面的应用潜力。
图3. 对混合数据集的三维再分类 本文将Apo-SA和Biotin-SA的数据集进行混合后继续进行三维分类，可以将无配体状态和有配体状态进行很好的分类。 亮点3：利用数据处理软件Relion中的颗粒分割（particle segmentation）和减法（subtraction）算法，获得了非对称的39kDa的SA三聚体的近原子分辨率结构。所以，本文认为，本文构建的单颗粒冷冻电镜方法具备可以解析约39kDa分子量的蛋白的能力。
图4. 通过算法实现的39kDa分子量的近原子分辨率结构 亮点4：从实验和数据处理上（一定程度上）鉴别了处于气-液界面的蛋白颗粒和附着在支撑膜（此处是石墨烯）的蛋白颗粒，并研究了不同分布的颗粒对于最终蛋白分辨率的贡献。 研究团队注意到，即使在通过2D分类对SA粒子图像进行仔细审查以去除所有明显的垃圾或坏颗粒之后，看似良好的颗粒只有约20％有助于三维分类后的正确高分辨率重建。尽管研究人员在图像处理程序上做了各种努力，但其他80％的颗粒图像都没有产生具有明显二级结构细节的重建，即使这些颗粒在我们的眼中看起来与用于高分辨率重建的良好颗粒非常相似。且含有这些颗粒的原始显微照片质量也很高。 正是由于这个“有趣”的发现，研究团队进行深入的研究，对样品载网进行电子断层成像后发现，蛋白颗粒主要分布在了沿Z轴的两个层中，一个是气-液界面（AWI），另一个是石墨烯-液体界面（GWI）。通过GWI颗粒分布的特异性和数据处理上的定位，研究人员将颗粒分为两部分，一部分是AWI颗粒（A子集）和GWI颗粒（B子集），最终发现附着在石墨烯上的蛋白（B子集）对于高分辨率的贡献更大，从而一定程度上证实了气液界面会破坏蛋白的结构（使蛋白部分解折叠）的理论。
图5. GWI和AWI界面颗粒的分布和对高分辨率的贡献 ——小结—— 小编认为这篇文章不仅仅是创造了单颗粒冷冻电镜技术解析原子分辨率结构的最小分子量记录，文中无论实验手段或是数据结果都有很多亮点，建议感兴趣的同学去仔细阅读，你一定不会感到无聊。 文章中的实验技术和手段对于解析小蛋白结构有很好的参考价值，希望将来此套方案可以发展成熟并进行规模化推广。 以上观点仅代表个人拙见，如有理解错误或者表达偏差，还请各位指正。 参考文献： Fan X, Wang J, et al. “Single particle cryo-EM reconstruction of 52 kDa streptavidin at 3.2 Angstrom resolution” Nature Communications 10.2386 (2019) |
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