2020年12月，来自佛罗里达H.Lee. Moffitt肿瘤研究中心的Gina M. DeNicola课题组在Cell Metabolism上发表了题为“Non-canonical Glutamate-Cysteine Ligase Activity Protects against Ferroptosis”的文章，报道了在NRF2激活的细胞中，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）通过合成γ-谷氨酰肽保护细胞免受由半胱氨酸饥饿诱导的铁死亡，这种保护作用不依赖于谷胱甘肽。
铁死亡是一种铁依赖性的非凋亡细胞死亡，由细胞内脂质氢过氧化物累积所致。半胱氨酸是维持细胞氧化还原稳态所必需的，半胱氨酸剥夺会诱导铁死亡。GSH是由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽，GSH的合成分两步进行。首先，通过GCLC连接谷氨酸和半胱氨酸，生成γ-谷氨酰-半胱氨酸(γ-Glu-Cys)。然后γ-Glu-Cys与甘氨酸连接，生成三肽GSH。虽然半胱氨酸与GSH合成直接相关，会影响ROS水平和脂质过氧化物酶GPX4的活性，但除了用于GSH合成，对胱氨酸饥饿的代谢后果了解甚少。
1.转硫途径不能支持NSCLC细胞系的半胱氨酸水平首先，对NSCLC细胞系进行胱氨酸饥饿处理导致细胞死亡，细胞死亡伴随着脂质过氧化物的积累，并可被铁死亡抑制剂所抑制。转硫途径可以使细胞从头合成半胱氨酸。通过碳同位素标记，发现在正常及饥饿条件下同位素标记半胱氨酸含量都极低，因此在胱氨酸饥饿处理4h后，细胞内半胱氨酸强烈耗竭。这些结果表明，转硫途径无法支持NSCLC细胞系中的半胱氨酸水平，从而导致在胱氨酸饥饿条件下半胱氨酸耗竭，GSH合成受损。A. 在胱氨酸缺乏和正常条件下，用DMSO或 Fer-1处理NSCLC后的细胞死亡。 B. 同位素标记丝氨酸示意图。 C-F.在缺乏胱氨酸(-)或富含胱氨酸(+)条件下培养4小时后，细胞内标记的丝氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的含量。
在胱氨酸饥饿后，尽管细胞内半胱氨酸被均一性耗竭，但NSCLC细胞系对铁死亡表现出了异质性。因此对A549细胞系进行了非靶向代谢组学研究，在大多数代谢产物耗尽时，部分代谢产物高度积累。这部分代谢产物被鉴定为γ-谷氨酰二肽或三肽。使用同位素标记谷氨酰胺，发现细胞内约有50%的谷氨酸及γ-谷氨酰肽被标记。在一组NSCLC细胞系中，胱氨酸饥饿后γ-谷氨酰肽水平与铁死亡敏感性呈负相关。这些结果表明胱氨酸饥饿促进谷氨酸衍生的γ-谷氨酰肽的积累，这可能在细胞对胱氨酸饥饿的反应中起作用。A. 在富含胱氨酸和饥饿条件下培养4h的A549细胞的代谢组学特征散点图。B, C. A549细胞在胱氨酸充足或缺乏条件下培养4h后，谷氨酰胺的同位素标记。D. 13种非小细胞肺癌细胞系的铁死亡与γ-谷氨酰肽水平之间的相关性。
由于在积累的γ-谷氨酰肽中，有与GSH相似的γ-Glu-2AB-Gly，γ-Glu-2AB-Gly由GCLC与GSS合成。因此假设γ-谷氨酰肽直接由GCLC合成。而在NSCLC细胞系中，在缺乏半胱氨酸的条件下γ-谷氨酰二肽水平与GCLC表达之间有很强的相关性。为了直接评估GCLC生产γ-谷氨酰二肽的情况，使用CRISPR/Cas9构建了GCLC KO和GSS KO的 A549克隆。尽管两种克隆都缺乏GSH合成能力，但只有GCLC KO细胞合成γ-谷氨酰二肽的能力受损。在Erastin处理或胱氨酸饥饿后，γ-谷氨酰肽的累积也通过GCLC抑制剂BSO处理而被阻断，表明GCLC的酶活性是γ-谷氨酰肽积累所必需的。这些结果表明，在胱氨酸缺乏条件下，γ-谷氨酰二肽由GCLC直接生成。A. 非小细胞肺癌细胞系中γ-谷氨酰二肽与GCLC表达的相关性。B. A549细胞系及GCLC KO和GSS KO克隆的免疫印迹。C, D. 在富含胱氨酸或缺乏胱氨酸的条件下2.5h，细胞内的GSH水平和γ-谷氨酰肽水平。E. 描述GCLC非典型γ-谷氨酰肽合成活性的示意图。
接下来，用PBS或cyst(e)inase处理小鼠以耗尽血清胱氨酸24小时，然后用盐水或BSO抑制GCLC。在另一项实验中，在一只成年小鼠中诱导全身性GCLC缺失。正如在细胞培养中所观察到的，半胱氨酸耗竭提高了γ-谷氨酰肽的水平，特别是在血清和肝中。此外， BSO处理或GCLC缺失耗尽了所有组织中γ-谷氨酰肽。总之，这些结果表明，GCLC介导体内合成γ-谷氨酰肽，以响应半胱氨酸剥夺。A. 描述cyst(e)inase和GCLC抑制剂BSO处理方案的示意图。B.成年小鼠中他莫昔芬(Tam)诱导的GCLC缺失后的mRNA水平。
NSCLC细胞系表现出γ-谷氨酰肽累积程度的广泛差异。通过检查整个NSCLC组中GCLC蛋白的表达，发现GCLC及其修饰亚单位GCLM的表达与NRF2的高活性相关，NRF2是GCLC和GCLM表达的已知调节因子。与KEAP1野生型细胞系相比，胱氨酸饥饿后KEAP1突变型NSCLC细胞系的γ-谷氨酰-肽水平始终显著较高。相反，在胱氨酸充足的条件下，NRF2促进GSH增加。总之，这些结果表明，NRF2对GCLC的调节在胱氨酸充足条件下促进GSH合成，但在胱氨酸缺乏条件下促进γ-谷氨酰肽合成。A.NRF2、GCLC、GSS和GCLM在NRF2LOW和NRF2HIGH细胞系中的免疫印迹。B. KEAP1WT和KEAP1MUT NSCLC细胞系中γ-谷氨酰肽水平的比较。
6.γ-谷氨酰二肽的合成保护KEAP1突变细胞免于铁死亡虽然发现GCLC的表达与铁死亡呈负相关，但外源性γ-Glu-Ala、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Val或γ-Glu-Gly未保护GCLC KOA549细胞抵抗胱氨酸饥饿诱导的铁死亡，尽管这些二肽被细胞稳健地摄取。BSO处理持续促进了胱氨酸饥饿下KEAP1突变细胞系的铁死亡，但对大多数KEAP1野生型细胞系没有显著影响。使用GCLC和GSS KO 的A549克隆，GCLC KO克隆在胱氨酸饥饿条件下加速诱导了铁死亡，这可以通过GCLC cDNA拯救。使用xCT抑制剂Erastin处理后也观察到类似结果。总之，这些数据表明，GCLC有一个额外的，不依赖于的GSH功能，以防止胱氨酸饥饿诱导的非小细胞肺癌细胞发生铁死亡。图6 γ-谷氨酰二肽的合成保护KEAP1突变细胞免于铁死亡A. 胱氨酸饥饿条件下的细胞死亡与非小细胞肺癌细胞中GCLC表达之间的相关性。B. 评估γ-谷氨酰二肽处理对胱氨酸饥饿条件下GCLC KO A549细胞死亡的影响。C. 在富含半胱氨酸和饥饿条件下，以及是否用BSO处理时，对NRF2HIGH和NRF2LOW细胞系死亡的评估。
γ-谷氨酰肽都具有共同的谷氨酸盐，但也含有可能在铁死亡中起作用的其他氨基酸。为了检验这种可能性，测试了胱氨酸饥饿条件下氨基酸的水平与铁死亡敏感性之间的关系，发现谷氨酸盐水平，而不是γ-谷氨酰肽中其他氨基酸的水平，与铁死亡有关。xCT可以向细胞外转运谷氨酸，然而仅在胱氨酸充足的条件下，观察到xCT表达与谷氨酸输出呈正相关。而在胱氨酸充足或缺乏条件下，GCLC蛋白水平和细胞内谷氨酸都是负相关的，表明在缺乏半胱氨酸的情况下，GCLC仍然能够限制细胞内谷氨酸。总之，这些结果表明，在胱氨酸饥饿条件下，通过GCLC合成二肽可作为谷氨酸库来限制谷氨酸的积累。A. 胱氨酸饥饿12小时后γ-谷氨酰肽底物氨基酸(Glu、Gly、Ala、Val、Thr和Leu)的细胞内浓度与胱氨酸饥饿诱导细胞死亡之间的相关性。B. 在富含半胱氨酸和饥饿条件下培养12 h的NSCLC细胞系中，xCT蛋白表达与Glu输出之间的相关性。C. 在富含半胱氨酸和饥饿条件下培养12 h的NSCLC细胞系中，GCLC蛋白表达与细胞内Glu水平之间的相关性。D. 左:在胱氨酸充足或缺乏条件下培养12h的NSCLC细胞系中细胞内Glu浓度分析。右:KEAP1WT和KEAP1MUT NSCLC细胞间的Glu浓度比较。
本文发现，在NRF2激活的细胞中，谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）通过合成γ-谷氨酰肽保护细胞免受由半胱氨酸饥饿诱导的铁死亡，这种保护作用不依赖于谷胱甘肽。虽然胱氨酸饥饿诱导的铁死亡通常归因于细胞GSH的耗竭，但本文描述了胱氨酸饥饿诱导细胞内复杂的代谢变化，表明胱氨酸饥饿会导致代谢失衡和谷氨酸盐积累，在铁死亡中起到作用。
参考文献： Kang, Yun Pyo, et al. "Non-canonical glutamate-cysteine ligase activity protects against ferroptosis." Cell Metabolism. (2020).
DOI:10.1016/j.cmet.2020.12.007
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