——绪论——多肽药物市场已经从2011年的141亿美元增加到2015年的500亿美元，并在2019年超过700亿美元[1]。 多肽类药物与其他类别的药物相比具有许多优势：它们具有良好的耐受性，具有易于插入的立体化学，从而提供选择性的靶点，并且在与大的蛋白质表面相互作用方面可以非常有效。事实上，多肽非常擅长与蛋白质上调节PPI的相当多的、通常是不稳定的表面结合[1]。 开发能够靶向细胞内靶点的大环肽是一个巨大的挑战。本文讨论了环肽药物的一些优势，主要参考中科院上海药物所陈士羽老师2022年发表在RCS Biology Review上的名为Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001–2021)的文章，介绍了过去二十年内一些典型的环肽药物及其功效，并对环肽药物设计的未来发展方向做出一点展望。 ——Why cyclic?—— 一、Peptides: linear VS cyclic： 线状多肽作为药物可能天生就不稳定，在细胞内蛋白水解的可能性很高。考虑到游离酸和游离胺位于两端，它们通常也是极性的。环化促进了环结构内的分子内氢键，降低了分子的外部氢键能力，与无环前体相比，这降低了分子的极性，增加了化合物的膜渗透性。环化引起的两个β-turn局部二级结构也会减少极性表面积，这通常会增强细胞的通透性[1]。 目前，已经有很多工作很完整地讨论过环肽的环化反应[2,3] ，环肽通常是通过头尾、头侧链或侧链到侧链的环化反应来产生的，如下图：
图片来源：Chem. Eur. J. 2021, 27, 1487–1513 合理的环肽骨架往往存在一些稳定的局部二级结构，这限制了环肽骨架的柔性，相对于线性多肽来说，环肽与靶点表面结合时所耗费的熵成本更小。另外环肽也可以被设计成为一种拮抗剂来模拟蛋白蛋白相互作用。强大的固相和液相合成方案的发展也使研究人员几乎可以产生任何肽序列，从而覆盖了非常有选择性的空间，包括加入非天然氨基酸，这些技术在环肽合成中均可以得到应用[4-6]。 二、环肽的细胞通透性： 环肽进入细胞的途径有三种：被动扩散途径、载体介导的转运途径和内吞作用途径[1]。如下图所示：
图片来源：Chem. Eur. J. 2021, 27, 1487–1513 被动扩散途径通常需要环肽分子具有较好的两亲性和较低的相对分子质量（<1000Da）才能够进入细胞。一些基于肽的药物被转运体识别，随后被输入细胞，一些环肽通过PepT1和PepT2转运体进入细胞。然而，这些受体主要在肠道（吸收）和肾脏（排泄）表达，因此它们对口服生物利用度和肽类药物的消除很重要，但不太可能参与靶组织的细胞渗透。并且内吞囊膜类似于细胞膜，非被动通透性的分子可能无法有效地逃脱内小体和溶酶体进入细胞质。因此，量化细胞内囊泡的药物释放是一个活跃的研究领域。所以要增强多肽类药物的细胞通透性，就要针对药物分子量和两亲性进行改良。然而环肽药物可以很灵活地实现这些需求，首先，对环肽分子的序列长短进行控制可以控制分子量要求，其次，通过对氨基酸的侧链（引入非天然氨基酸、形成二硫键等）或者主链（N甲基化等）进行改性，引入非天然的疏水基团可以增强环肽分子的疏水性，从而提高环肽药物分子的细胞通透性。并且，进一步可以针对骨架的对称性（引入D型氨基酸）来进一步优化环肽分子的亲疏水特性。
图：生长抑素、Veber-Hirschmann肽和N-甲基化Veber-Hirschmann肽类似物的结构。对生物活性至关重要的残基用蓝色表示，N-甲基用红色突出显示。 图片来源：Chem. Eur. J. 2021, 27, 1487–1513 环肽的细胞通透性由五个性质决定，包括氢键势、构象、电荷、大小和疏水性。Lipinski规则经常用于预测分子被动扩散到细胞内的能力。符合这些参数的小分子更有可能具有良好的药代动力学特性。五规则规定，类药物分子的分子量（MW）应小于500，分配系数（LogP）应小于5，氢键供体应少于5，氢键受体应少于10。一些最近的工作扩大了标准，以适应肽类：其中设计环肽时的建议包括将logP设定在0到7.5之间，PSA<200 Å2，这对于环肽体系而言也是可以通过对主链和侧链进行改性而实现的。 ——环肽药物汇总—— 一、靶向细胞内蛋白的环肽药物[2]： 罗米地辛（Istodax），目前由美国Celgene拥有，是1994年日本筑波的 Fujisawa 制药公司（现为Astellas Pharma）从紫色色杆菌中获得的一种天然双环肽，并于2009年被FDA批准用于皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）。罗米地辛是一种相当小的环肽，含有一个头尾内酯环状结构。罗米地辛是一种前体药物，它将细胞内基质中的二硫键还原为两个硫醇。一旦被降解，硫醇可以螯合组蛋白脱乙酰化酶（HDAC）活性部位的锌，从而抑制组蛋白脱乙酰化酶并诱导细胞凋亡。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Voclosporin是由 Robert T. Foster 和他的团队在 1990 年代中期在 Isotechnika公司发现的。2021年1月22日， FDA批准Voclosporin用于狼疮性肾炎（LN）的治疗，Voclosporin是从环孢菌素中开发出来的，具有更强的药效和代谢稳定性，全长11个残基，只有一个D-氨基酸，具有头尾环化的结构。一些氨基酸底物被S-腺苷蛋氨酸N甲基化。Voclosporin通过阻断钙调节的丝氨酸-苏氨酸磷酸酶钙嘌呤的活性，在抑制T细胞增殖和阻止促炎细胞因子的释放方面发挥重要作用。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 二、靶向膜外蛋白的环肽药物[2]： 在过去的二十年中，有一半的环肽以细胞外蛋白为靶标，主要与GPCRs相互作用。目前为止，大多数GPCR靶向治疗药物都是小分子；另一方面，许多GPCR的内源性配体是肽（由50个或更少的氨基酸组成），这表明这类分子可能在治疗上有用，可以通过修饰来开发基于肽的治疗药物。 齐考诺肽（Prialt），因其给药途径也称为鞘内齐考诺肽 (ITZ)，它源自锥螺（Conus magus），通过鞘内注射的方式给药，作为N型钙通道的有效和选择性阻滞剂，Zicondotide被批准用于治疗严重的慢性疼痛，它的威力是吗啡的1000 倍。齐考诺肽的三维结构已经通过磁共振方法获得，C1- C16、C8- C20 和 C15- C25 二硫键使多肽折叠成为 ω结（一种蛋白质的二级结构）, 具有ω家族的特征。除了二硫键外, 还有3股β折叠进一步稳定结构。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 利那洛肽（在美国和墨西哥以 Linzess 品牌销售，在其他地方以Constella为名销售），是一种口服14个氨基酸的合成肽，是上世纪90年代开发的一种高亲和力鸟苷酸环化酶C激动剂（GC-C），用于治疗便秘和慢性便秘的肠易激综合征，但是对于儿童有导致严重脱水的风险。利那洛肽保留了外源性GC-C配体肠毒素ST的Cys5-Cys17（ST2）或Cys6-Cys18（ST1）之间的片段，并做了Leu4Tyr突变，删除一些不利于结构稳定的片段，最终优化出了当前的结构，如下图：
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Plecanatide（Trulance）是一种16个氨基酸的肽，除了用Glu3取代AsP3外，在结构上与人尿鸟苷几乎相同。Plecanatide受两对二硫键的限制，在pH值为5.0时，即十二指肠和空肠近端的pH值下采用活性构象与鸟苷酸环化酶-C（GC-C）受体结合。激活胃肠道中的GC-C受体可以刺激细胞内产生环磷酸鸟苷（CGMP），进而激活囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）和cGMP依赖的蛋白激酶G-II。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Pasireotide（Signifor）是一种在美国和欧盟批准的孤儿药，用于治疗失败或不适合手术治疗的库欣病患者。它是由诺华公司开发的一种生长抑素类似物，属于生长素抑制剂的第二代类似物，与其他生长抑素类似物相比，Pasireotide与生长抑素受体的亲和力增加了9-40倍。Pasireotide是一种头到尾通过酰胺键环化的六肽。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Lanreotide（Somatuline）也是生长抑素的八肽类似物，于2014年批准用于治疗转移性胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-Nets），并于2017年批准用于治疗类癌综合征，它被半胱氨酸2和半胱氨酸7之间形成的一对二硫化物环化。（有趣的是，Lanreotide 已被证明可自发地自组装成直径为 24.4 nm 的单分散纳米管，此后在多项生物物理研究中被用作富有成效的多功能模型系统）。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Vasopressin（Vasostrict）是一种抗利尿激素，由天然的九个氨基酸通过Cys4和Cys9之间的二硫键环化而成。Vasopressin通过激活V1受体介导血管收缩，从而促进抗利尿活性和对血管平滑肌的促凝活性。但是Vasopressin是非选择性的，同时具有激活V1a、V2、V1b和催产素受体的亲和力。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Terlipressin是一种人工合成的长效vasopressin类似物，如上图，Vasopressin的结构发生Arg8Lys突变，再在N端引入三个Poly-Gly的片段，就形成了Terlipressin的结构。发生上述结构变化后，环肽药物结构上的Cys1位与Tyr2之间的酰胺键被切断后才发挥作用，这将原始的Vasopressin的半衰期由24min提升到了6h。Terlipressin同样作用于vasopressin受体V1a，V1b和V2，具有更好的安全性，副作用比vasopressin更少。Terlipressin由内肽酶代谢，通过去除N位的甘氨酸残基形成赖氨酸vasopressin。
图片来源： RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Bremelanotide（Vyleesi）是一种七肽，环化在Asp2和Lys7的侧链之间，形成α-黑素细胞刺激素（a-MSH）的内酰胺类似物。Bremelanotide 是黑素皮质素受体的非选择性激动剂，主要作用于MC3和MC4受体，用于治疗绝经前妇女的全身性性欲减退症(HSDD)。
图片来源： RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Setmelanotide（Imcivree）是一种二硫键环化八肽，特异性作用于黑素皮质素4受体(MC4R)，EC50为0.27 nM。Terlipressin和setmelanoide是目前仅有的两种已被批准的，由天然线性激素通过引入环化桥来锁定与靶标结合的部分序列的循环构象而发展而来的。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 三、抗菌肽[2]： Daptomycin（Cubicin） 是从玫瑰孢子链霉菌（Streptomyces Roseosporus）中分离得到的一种环状脂肽抗生素。Daptomycin全长13个残基，有两个非规范氨基酸，其中10个在Thr4的侧链和C-末端之间形成内酯结构，形成环状排列。达托霉素的作用是以磷脂酰甘油依赖的方式将其癸酸插入革兰氏阳性细菌的细胞壁。聚集的达托霉素在目标细菌的细胞膜上造成孔洞，破坏膜的曲率，导致离子泄漏和膜电位损失。因此，蛋白质、DNA和RNA合成的细胞活性受到抑制，并诱导细胞凋亡。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Telavancin（Vibativ）是万古霉素的半合成衍生物，通过将万古霉素氮与环肽残基上的癸氨乙基侧链和亲水性膦甲氨基甲基烷基化而获得，以获得更强的效力和更快的作用。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Dalbavancin（Dalvance）是一种新的第二代脂糖肽抗生素药物，Dalbavancin是与万古霉素属于同一糖肽类的脂糖肽。与其他糖肽类似，Dalbavancin通过破坏细胞壁生物合成发挥其杀菌作用。它与生长的肽聚糖链上的 D-丙氨酰-D-丙氨酰残基结合，防止转肽发生，防止肽聚糖伸长和细胞壁形成。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Oritavancin（Orbactiv）是由氯霉素衍生的万古霉素的合成类似物，它的不同之处在于增加了一个亲脂性的N-4-(4-氯苯基)苄基侧，4'-氯联苯甲基破坏革兰氏阳性菌的细胞膜。它还通过抑制糖基转移作用和抑制肽转移作用而起作用。七肽核心与万古霉素具有相同的结构，糖基化作用与氯霉素相同。这种结构变化增强了对万古霉素敏感肠球菌(VSE)和万古霉素耐药肠球菌(VRE)的活性。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 Caspofungin（Cancidas）, Micafungin（Mycamine） and Anidulafungin（Eraxis, Ecalta） 均属于环状六脂肽家族。它们具有具有相同的环肽核心结构，向合成细胞壁靶葡聚糖至关重要的的酶——1，3-b-葡聚糖合成酶 。环化反应是由赖氨酸的第一个N端残基的侧链和肽链的C端之间的酰胺化形成的。三种抗真菌药物都对侵袭性念珠菌病和其他形式的系统性真菌病有临床疗效。
化合物图片来自wikipedia，右边的药物信息总结参考自 RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 ——展望：Ab Initio Design—— 能够与细胞内靶点结合的环肽是一个巨大的挑战，了解分子识别和结合位于细胞内的靶并随后引发生物反应所需的复杂途径是很重要的。目前的我们主要从天然产物骨架出发，对其进行化学改性开发新型的环肽药物。但是天然的骨架结构并不能覆盖更加广阔的序列和构象空间，因此在未来基于靶点结构的环肽药物的从头设计也会是一个潜力很大的研究方向。 目前基于结构从头设计序列并且进行构象生成与优化方向的工作依旧不是很丰富。当然也有一些比较成功的相关例子，比如2017年华盛顿大学David baker教授组里发表在Sience上的工作[7]就从Poly-Gly出发同时使用L、D两种手性的氨基酸来拓宽构象空间从而得到一系列稳定的多肽骨架同时进行序列设计，最后拿到了200多个（长度为7-10个氨基酸）环肽，并且在文章中对环肽骨架的稳定性和小环肽的功能化做了讨论，可以很好地作为环肽从头设计的指南手册。
图：A、B分别代表可以形成 α-螺旋和 β-折叠的主链二面角，X、Y是他们的对映异构体；左图：a：主链二面角采样，b：对称性收敛过程，c：结构随机采样分布，d：与天然环肽的丰度对比；右图：一些设计得到的较为稳定的环肽中的二级结构，柱状图红色代表天然环肽中出现的频次，蓝色代表设计的到结构中出现的频次。 图片来源：Science 358.6369(2017):1461-1466. 还有就是2019年Scripps的Michel F. Sanner教授组发表在JCTC上的工作[8]，他们基于CRANKITE（一种多肽构象微扰优化的算法，类似Rosetta的FlexPepDock）和AutoDock’s affinity maps，并且加入针对二硫键和酰胺键的环化势能打分项，来从序列出发通过Monte-Carlo采样算法框架进行多肽的环化与对接。
图：环肽结构扰动示意图（左）；对接效率统计图（右） nc代表native contact。 图片来源：J. Chem. Theory Comput. 2019, 15, 5161−5168. 类似的工作还有很多，计算设计的方法拓宽了环肽的序列与构象空间，为更丰富的环肽药物的诞生提供了蓝图。 [1] Huiya Zhang and Shiyu Chen, RSC Chem. Biol., 2022, 3, 18-31 [2] Laura K. Buckton, et al., Chem. Eur. J. 2021, 27, 1487–1513 [3] S. Usmani, et al., PLoS One, 2017,12(7), e0181748. [4] Zorzi, K. Deyle and C. Heinis, Curr. Opin. Chem. Biol., 2017, 38, 24–29. [5] C. Sohrabi, A. Foster and A. Tavassoli, Nat. Rev. Chem., 2020, 4(2), 90–101. [6] D. J. Craik, Chemistry. Science, 2006, 311(5767): 1563–1564. [7] Hosseinzadeh, P. , et al. Science 358.6369(2017):1461-1466. [8] Yuqi Zhang, et al. J. Chem. Theory Comput. 2019, 15, 5161−5168 |
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