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进入21世纪以后，创新的药物治疗方法（从抗体、ADC、CAR-T和TCR-T、基因治疗，到蛋白质降解剂……）爆炸性增长且层出不穷。那么下一种新的药物治疗方法会是什么？ 2022年8月16日，来自Dewpoint Therapeutics公司的Isaac A. Klein和Mark A. Murcko等人在顶尖药学综述Nature Reviews Drug Discovery发表长文，介绍了生物分子凝聚物的生物学、医学原理以及由此产生的一种新的治疗方法——凝聚物修饰疗法（condensate-modifying therapeutics, c-mod）。  Dewpoint被认为是第一家将对生物分子凝聚物的理解应用于药物发现的公司。在过去几年中，Dewpoint投资了一个数字发现平台和先进的“湿实验室”方法来研究凝聚物的功能和靶向机制。（见本公众号文章 AI+生物分子凝聚物｜Dewpoint获1.5亿美元C轮融资） 摘要 在过去的十年中，被称为生物分子凝聚物的无膜组件，通过在具有不同特性的亚细胞环境中分隔特定的蛋白质和核酸，在许多细胞功能中发挥关键作用。对正常和异常细胞状态下的凝聚物功能以及凝聚物形成机制的新认识，为人类疾病提供了新的见解，并揭示了新的治疗机会。 前言 一个多世纪以来，科学家们对原生质体的结构和组织进行了研究。除了有膜的细胞器，如细胞核和线粒体，显微镜下还观察到缺乏膜的细胞器。例如，核仁是在19世纪30年代首次被描述的。在二十世纪初，更多的无膜细胞器被鉴定出来，此后又有许多其他的报告。尽管这些集合体（现在被称为生物分子凝聚物）的功能在某些情况下已经被描述（表1），但控制其形成、结构、动力学、组成和活性的机制现在才被深入研究（图1）。 表1 生物分子凝聚物的功能作用（部分）   图1 三个生物分子凝聚物及其组成成分 生物分子凝聚物领域的研究在2015年达到了一个拐点，有多篇出版物报告了突破性的发现。从那时起，该领域的研究迅速发展。 此类研究中出现的一些证据支持生物分子凝聚物与药物发现的相关性。越来越多的例子表明，凝聚物的”异常行为”与疾病状态有关，包括神经变性、癌症（如前列腺癌）、病毒感染（如呼吸道合胞病毒）和心脏疾病。在神经退行性疾病中具有高度治疗意义的蛋白质，如TDP43和FUS，已在凝聚物内被发现。抗癌药物顺铂和他莫昔芬可以进入转录凝聚物，改变其在培养细胞和体外重组模型凝聚物中的组成；初步报告显示，在基于细胞的研究中，小分子可以改变凝聚物的行为，产生功能结果。最后，研究凝聚物的工具正在迅速成熟，丰富了研究凝聚物修饰疗法（c-mod）的工具箱。 本文简要描述了生物分子凝聚物形成的物理学和结构基础，概述了凝聚物在细胞功能中发挥的各种作用，以及一些关于异常凝聚物与疾病的关联的证据。然后，描述了识别和表征能够调节或以其他方式利用凝聚物的候选药物的方法和技术，并考虑了相关需要挑战。 凝聚物生物学概述 生物分子凝聚物与许多细胞过程有关，包括对压力的感觉和反应、生物化学反应的分隔、机械调节和信号传递。它们的组成通常是复杂的，由数百种不同的蛋白质和核酸组成，形成一个广泛的分子间网络，其长度尺度从纳米到微米。生物分子凝聚物组装的基本机制取决于它们的组成和结构。这种组装是由多价相互作用介导的，导致选定的分子群落的局部浓度增加，这创造了一个具有独特性质的微环境。 针对凝聚物内分子群落的新兴特性，可以开发新的治疗方法。 凝聚物组装的原理、物理特性、功能和调节 许多生物分子凝聚物被认为是以浓度依赖的方式进行组装，通过选定的一组蛋白质和/或核酸的自发或有核相分离，形成非配位大分子组合。当生物分子的浓度超过饱和浓度（Csat）时就会发生相分离。 越过相界的生物分子浓度的微小变化会触发一个剧烈的、类似开关的反应，导致凝聚物的形成或溶解，有效地改变局部浓度，有时超过几个数量级（图2a）。重要的是，这个过程是快速和可逆的，使其成为感知压力和其他环境变化的理想元素。  图2：凝聚物的组装原理及其调节 生物分子凝聚物表现出一系列的材料特性。这些材料特性与凝聚物的组成和生物功能相关，可以通过环境的变化或活跃的生物过程进行动态调控。例如，液态的特性使应力颗粒能够随着条件的变化而迅速组装和拆卸。 凝聚物提供了一个独特环境。凝聚物内的环境通过分隔参与相关生物过程的成分来调节酶的反应。这种独特的环境可以调节以下一个或多个参数：成分的扩散、底物的富集和/或抑制剂的耗尽。 生物分子凝聚物能以较低的能量阈值对突然的环境变化（如温度、压力、饥饿、检测到外来物质或其他细胞刺激）做出快速反应。相分离提供了一种可逆的机制，可以增加凝聚物中特定成分的局部浓度，同时减少其在外部环境中的浓度。这种过程涉及到减轻细胞的毒性，通过封存多余的物质来应对压力。 生物分子凝聚物的组成是复杂的、动态的，并随细胞类型和诱导凝聚物形成的信号类型而变化。环境的微小变化（例如，代谢物或生物分子的浓度、pH值或温度）会使凝聚物溶解或聚集，产生一个快速开关般的信号（图2a）。 此外，蛋白质成分的共价翻译后修饰（PTMs，如磷酸化、乙酰化、甲基化、SUMO化、泛素化等）可以调节凝聚物的组装和拆卸。 总之，这些管理其行为、功能和调节的机制在细胞内凝聚物的正常功能中起着重要作用，并为设计策略以纠正其在疾病中的功能失调提供了宝贵的见解。 疾病中的凝聚物 在此，我们将”凝聚物病变”定义为驱动特定疾病表型的凝聚物异常，这已在神经退行性疾病、扩张型心肌病、某些类型癌症的体外模型系统和体内细胞和动物模型中观察到。 在ALS/FTD中反复出现的病理观察是富含TDP43的细胞质颗粒的存在，而不管TDP43基因是否有突变。体外和细胞的数据表明，这些颗粒是以凝聚物的形式出现的，并经历了老化。 在先天性扩张型心肌病患者中发现的组织特异性替代剪接因子RBM20的基因突变，其特点是RNP凝聚物缺陷。 最近的进展表明，凝聚物病变与几种类型的癌症之间存在联系。这些凝聚物病变使许多过程失调，包括但不限于基因组稳定性、信号传导、蛋白质质量控制和转录。 生物分子凝聚物也被病原体如病毒所利用，以更有效地劫持宿主细胞和逃避宿主先天免疫的自我防御机制。 药物发现策略 凝聚物在正常和异常细胞功能中的作用越来越清晰，现在有一系列的工具可以用来研究这些细胞现象，包括蛋白质邻近标记、先进的显微镜技术和计算方法。因此，现在有越来越多的机会来探索以凝聚物为基础的药物发现方法。 作者引入凝聚物修饰疗法（condensate-modifying therapeutics, c-mod）这一术语来描述调节特定生物分子凝聚物的物理特性、大分子网络、组成、动力学和/或功能以预防或逆转疾病的药物。 一个c-mod疗法可能有以下三个目标之一：修复凝聚物病变；破坏与疾病有关的凝聚物的正常功能；或者通过使目标物丧失功能、或通过将目标物从其原生凝聚物中分离出来来防止目标物发挥作用（图3a）。在每一种情况下，药物发现策略都将基于一个筛选和验证模型。  图3：开发c-mod的目标和策略 a | 凝聚物修饰疗法（c-mod）的开发是为了实现以下一个或多个目标：修复或消除凝聚物病变（左）；通过使特定目标脱离其原生凝聚物（中）或使其在凝聚物中失去活性而阻止其发挥作用；或破坏正常凝聚物的功能（右）。b | 用c-mod调节凝聚物新特性的策略，在文中有详细描述。这些策略可以单独使用，也可以组合使用，任何一种策略都可以影响凝聚物的多种特性。 C-mod发现策略 我们可以设想出多种策略来实现C-mod的这三个目标。在任何情况下，首选的策略将取决于所期望的药理结果和对特定凝聚物的成分、结构和功能的详细了解。 调节凝聚物的骨架 调节凝聚物骨架预计会对凝聚物的稳定性产生巨大的影响，如持久性、Csat（即形成或溶解）（图3b）、材料特性和/或组成。如果一个c-mod插在两个或更多的凝聚物成分之间，或改变相互作用价或（共）骨架之间的相互作用强度（在折叠和/或无序结构域内），它也可能改变材料特性。 骨架的调节可以通过各种方式实现。一种方法是调控价位。第二种方法是直接阻断或稳定有助于骨架作用的蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸或核酸-核酸相互作用。 已经报道了几个令人鼓舞的凝集剂靶向抗病毒药物发现的概念证明（尽管确切的作用机制还没有完全阐明）。如：小分子如卡那霉素在体外和培养的细胞中都能破坏含有核壳的生物分子凝聚物的稳定性，一种抑制核苷酸二聚体的肽可以防止凝集和病毒复制，并在活细胞和小鼠模型中拯救先天免疫反应。 调控凝聚物的组成 凝聚物成分的变化可以影响许多特征，从材料特性（例如，粘度和表面张力），到动力学和对环境刺激的反应能力（例如，持久性和老化），到单个成分的酶活性。我们可以设想出抑制或促进目标物与骨架之间相互作用的C-mods方法，将目标物排除出或纳入到凝聚物中。 调控构象和相互作用情况 与蛋白质的IDRs相互作用的C-mod可能会改变该蛋白质分化成凝聚物的能力，或阻止该蛋白质与凝聚物中的其他生物分子形成各种分子间相互作用。 一些药物靶点，包括转录因子（如MYC）、激素受体（如雄性激素受体）和核苷酸结合蛋白（如TDP43），含有IDRs，并且已知定位于生物分子凝聚物。 借助凝聚物内产生高的局部药物浓度的能力，可能能够开发低亲和力但高度游离的药物，这些药物能有效地靶向这些家族中的蛋白质，而这些蛋白质到目前为止是非常具有挑战性的。 降解剂 从凝聚物中有效去除特定蛋白的一种方法是使用蛋白分解-靶向嵌合体（PROTAC）或分子胶策略来降解它。我们可以设想降解一个骨架，使其有效浓度低于Csat，从而防止或逆转凝聚物的组装。 调节凝聚物的调节过程 诸如伴侣蛋白和螺旋酶等酶在调节凝聚物环境方面可以发挥关键作用。这种调节可以普遍影响凝聚物环境，也可以更有选择地影响特定蛋白质或核酸的行为，或者阻止它们与通常的伙伴分子相互作用，或者极大地影响它们的特性（例如构象、溶解度和价位），使它们从凝聚物中分离出来。 优化药物在凝聚物中的分配 凝聚物含有关键的药物靶点，如酶、转录因子、DNA和协同激活剂。这创造了一个独特的局部微环境，可以选择性地增加或减少小分子的浓度，从而影响它们的靶标参与和治疗效果（图3b）。 考虑因素和挑战 不过，生物分子凝聚物的组成的复杂性、大小和动态性给药物发现带来了一些挑战。 首先，反映相关生物学的可靠模型和明确定义的凝聚物特征的指标是必须的。 第二，C-mod的发现将取决于细胞表型的检测，而表型方法的靶点鉴定很少是简单的。C-mod可能通过广泛的机制影响凝聚物，从与凝聚物中的一个或多个生物分子的直接相互作用，到对凝聚物新兴特性的一般影响，到改变蛋白质的PTM，从而阻止它们进入凝聚物。对于一些c-mod的发现工作，靶点将是未知的，化合物的优化工作将完全由表型的细胞试验来驱动。 第三个挑战是如何优化c-mod在疾病相关凝聚物中的选择性分配。凝聚物的特性差异很大，而且难以量化。为了提高治疗指数，诸如极性、亲油性、氢键供体/受体数量、电荷、整体形状、柔韧性、芳香性和特定官能团的存在等特性都可能影响分配，并为特定的凝聚物环境进行优化。 构建一个 c-mod 发现平台 将Dewpoint对生物分子凝聚物及其参与疾病的知识转化为c-mod需要一个新的药物发现平台，它可以分为四个主要部分（图4）： 确定与疾病相关的目标凝聚物，并提出假设，说明目标凝聚物的修饰如何在疾病的细胞模型中产生预期的功能效应（凝聚物假设）； 对目标凝聚物进行表征，并开发测定这种效应的方法，以验证该假设； 进行高通量筛选（HTS），以确定能够逆转或防止异常凝聚物表型的潜在c-mod； 根据预期的、与疾病相关的功能结果进行hit-lead的优化。  图4：建立一个c-mod发现管道。以NUP98-HOXA9为例进行研究 形成凝聚物假设 以凝聚物为中心的药物发现的最初步骤是选择一个目标凝聚物并制定一个凝聚物假设。目标可以来自几个方面，包括预先存在的关于凝聚物的疾病相关性的数据、凝聚物病的重新鉴定或传统靶点的凝聚物关联的重新鉴定。 此外，计算方法有可能先验地解码生物分子如何合作形成凝聚物或推定的c-mod如何影响凝聚物，并帮助从头发现c-mod。然而，凝聚物的复杂性给计算方法带来了挑战。计算分析可以采取数据挖掘的形式，利用现有的凝聚物组成知识和体外简化系统的特性来产生预测。在这种情况下，一些相分离蛋白或凝聚物成分的数据库已经开始被整理出来。 凝聚物的特征 为了了解凝聚物，我们必须在最大程度上描述组成凝聚物的生物分子群落的特征。这些信息可以用来描述凝聚物的特征，选择合适的HTS表型检测来识别c-mod，并审视c-mod的作用机制。组成分析可以通过亚细胞蛋白质组和转录组分析或多重成像方法进行。 由于凝聚物成分的复杂性和相位行为调节的各种平行模式，分解特定成分对活细胞中凝聚物的表型和行为的贡献仍然具有挑战性。 初级筛选 在开始对潜在的C-mod进行HTS活动时，应该具备以下条件：一个经过验证的凝聚物假设；一套强大的、可扩展的表型和疾病相关的功能检测；以及一个能够调查结构-活性关系的检测方法，以便对hit进行优化。 二级筛选和hit优化 展望 生物分子凝聚物正在成为具有吸引力的药物发现的新目标。许多具有高度治疗意义的蛋白质和核酸，包括许多以前被认为是“不可治疗的”靶点，都在凝聚物中起作用。 首先，一些已获批准的药物已被证明可以进入凝聚物。其次，高通量的细胞筛选已经确定了类似药物的分子，这些分子以选择性的方式调节凝聚物的行为。第三，现在人们了解到PTMs可以强烈调节凝聚物的形成、行为和溶解。综上所述，我们可以推测，许多已获批准的药物可能在某种程度上是作为c-mod发挥作用的，例如通过修改与疾病有关的凝聚物来发挥其部分药理作用。 IDR相互作用组的变化可以导致凝聚物骨架、组成、动态、材料特性和功能输出的改变。靶向凝聚物而不是该分子群体中的单个突变可能提供一个途径，为更多的患者群体提供更广泛的治疗方法。 凝聚物的高度复杂性和动态性质为c-mod的发现带来了一些独特的挑战和机会。例如，c-mod可以表现出不寻常的剂量反应行为，它可以根据实验条件的不同而变化。 由于凝聚物的复杂性，以及导致凝聚物形成的力量的性质，使分子群体的多个组成部分参与其中的药物组合可能是特别重要的。此外，可以设想一种c-mod与一个蛋白质上的多个位点或许多相关的蛋白质弱弱地结合；这种单价化合物，以超比例的方式结合，预计会降低骨架上的价位，从而破坏凝聚物的稳定性。为了稳定促进相互作用的构象状态，人们可以采取分子胶策略，迫使生物分子保持在相关或近似的状态。 c-mod存在许多问题和挑战，这也是社区积极研究的主题。例如，我们如何证明疾病和凝聚物之间的因果关系？我们如何确定多基因疾病的”关键”凝聚物问题？哪些是了解凝聚物功能和c-mod的影响的最有信息量的成分？为了应对这些挑战，药学人员必须了解目标凝聚物的各个组成部分以及分子群体的集体行为。 将”凝聚物观点”纳入药物发现过程，对开发创新机制的药物具有重大潜力。 参考资料 Mitrea DM, Mittasch M, Gomes BF, Klein IA, Murcko MA. Modulating biomolecular condensates: a novel approach to drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2022 Aug 16:1–22. doi: 10.1038/s41573-022-00505-4. |
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