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文章信息 题目：The role of watermelon caffeic acid O-methyltransferase (ClCOMT1) in melatonin biosynthesis and abiotic stress tolerance 刊名：Horticulture Research 作者：Jingjing Chang，Xian Zhang & Hao Li et al. 单位：Northwest A&F University 日期：01 October 2021 摘要 1 褪黑激素是一种多效性信号分子，可调节植物生长和对各种非生物胁迫的反应。植物中褪黑激素合成的最后一步由咖啡酸O-甲基转移酶 (COMT) 催化，据报道，这是一种具有N-乙酰血清素O-甲基转移酶 (ASMT) 活性的多功能酶；然而，COMT 的 ASMT 活性尚未在西瓜 ( Citrullus lanatus ) 等非模式植物中得到表征。在这里，在西瓜中鉴定了总共 16 个推定的O-甲基转移酶( ClOMT ) 基因。其中，ClOMT03（Cla97C07G144540）被认为是潜在的COMT基因（重命名为ClCOMT1）基于其与已知COMT基因的高度同一性（60.00-74.93%），参与褪黑激素生物合成、几乎所有组织中的表达以及非生物胁迫下的上调。ClCOMT1 蛋白定位于细胞质中。ClCOMT1的过表达显着增加了褪黑激素的含量，而使用 CRISPR/Cas-9 系统敲除ClCOMT1降低了西瓜愈伤组织中的褪黑激素含量。这些结果表明ClCOMT1在西瓜褪黑激素的生物合成中起重要作用。此外，寒冷、干旱和盐胁迫下西瓜中ClCOMT1的表达上调，同时褪黑激素含量增加。过度表达ClCOMT1增强了转基因拟南芥对这种非生物胁迫的耐受性，表明ClCOMT1是植物对非生物胁迫耐受的正调节因子。 技术路线 2
主要结果 3 3.1 西瓜ClOMT基因的生物信息学分析及表达谱测定 使用 HMM 搜索程序在西瓜中鉴定了总共 16 个推定的ClOMT基因，并根据它们在西瓜参考基因组中的基因 ID 将其重命名为ClOMT01至ClOMT16 （表1）。在ClOMT蛋白中，ClOMT03被注释为咖啡酸3 - O-甲基转移酶1，而ClOMT01和ClOMT02被注释为咖啡酸3 - O-甲基转移酶。
16个ClOMT基因在西瓜基因组的02、07、09和10号染色体上分布不均（图1A）。一些ClOMT映射到同一染色体上的相邻区域。根据定义，ClOMT01、ClOMT02、ClOMT03、ClOMT06、ClOMT07和ClOMT16不是串联重复基因，而其他ClOMT基因似乎是由串联重复产生的。如图1B所示，ClOMTs根据系统发育分析分为三组（I-III），I组中有10个ClOMT，II组中有2个（ClOMT04和ClOMT05），III组有4个（ClOMT01，ClOMT02，ClOMT03和ClOMT16）。
基于来自 CuGenDB ( http:/// )的 RNA-seq 数据分析了ClOMT基因的时空表达。只有ClOMT02、ClOMT03和ClOMT16在所有测试的西瓜组织中组成型表达，包括果肉、果皮、种子、韧皮部、维管束、根和叶组织（图2A）。ClOMT01基因仅在种子中未检测到，而ClOMT04和ClOMT05仅在授粉后34天的果肉中未检测到。I 组中的大多数ClOMT基因在果肉、果皮或种子中未检测到。ClOMT14在任何测试的组织中都没有观察到表达。
各种非生物胁迫可诱导褪黑激素的产生。我们进一步分析了使用 20% PEG 6000 模拟的ClOMT基因响应非生物胁迫（包括寒冷、干旱和渗透胁迫）的表达。ClOMT基因在响应不同胁迫时表现出不同的表达模式（图2B）。只有ClOMT03表达被所有三种胁迫上调。在干旱和渗透胁迫下，ClOMT04和ClOMT05的表达上调。ClOMT08和ClOMT16的转录水平仅由渗透胁迫诱导，而ClOMT07仅由干旱引起。 3.2 ClCOMT1蛋白的序列分析和亚细胞定位 为了进一步缩小候选COMT基因的范围，我们分析了ClOMT01、ClOMT02、ClOMT03和ClOMT16与其他植物物种中报道的ASMT和褪黑激素生物合成相关COMT的序列同一性（表2）。这四种ClOMT与拟南芥、海棠和水稻中的ASMT 的同一性 <43%。ClOMT03基因与拟南芥中的COMT具有最高的同一性(74.93%)、与番茄和大米的同源性为74.30%和60.00%。基于上述结果，ClOMT03被认为是参与褪黑激素生物合成的潜在西瓜COMT基因，并更名为ClCOMT1。
与来自双子叶植物拟南芥和番茄的已知 COMT 蛋白一样，ClCOMT1 含有相对保守的 NAS 结合结构域、酚类底物结合残基和S-腺苷-L-蛋氨酸结合位点（图3）。然而，来自双子叶西瓜和单子叶水稻的 COMT 蛋白的 NAS 结合结构域差异很大。
已知水稻和番茄中的 COMT 蛋白定位于细胞质。为了确定ClCOMT1是否也定位于细胞质中，使用pGREEN-ClCOMT1-GFP载体研究了ClCOMT1在西瓜中的亚细胞定位。如图4，在细胞质中观察到绿色荧光，表明ClCOMT1的细胞质定位。绿色荧光与叶绿素自发荧光的红色荧光不重叠，表明 ClCOMT1 没有易位到叶绿体中。
3.3 ClCOMT1基因编辑或过表达对西瓜愈伤组织内源性褪黑素含量的影响 为了确定ClCOMT1直接参与褪黑激素的生物合成，产生了具有敲除和过表达ClCOMT1的转基因西瓜愈伤组织。使用 CRISPR/Cas9 系统敲除西瓜愈伤组织中的ClCOMT1 。ClCOMT1基因5' 区域上的两个靶位点（靶标 1 和靶标 2）被组装到 CRISPR/Cas9 载体 PBSE402 中（图5A、B）。改造后得到5个基因编辑株系。#1-#4在目标 2 位点发生突变，#5在目标 1 位点发生突变（图5C）。#5 的突变率最高 (100%)，其次是 #2 (85.5%)、#3 (79.7%)、#4 (74.0%) 和 #1 (63.2%)。所有品系都是杂合的，每个品系有 2-4 种突变类型。例如，#5 在目标 1 中具有两种突变类型（-19、-10），而#3 在目标 2 中具有四种（-2、-35、-24、-36）。ClCOMT1的突变导致褪黑激素含量显着减少（图5D）。编辑系中的褪黑激素含量比野生型愈伤组织中的低 33.7-56.3%。此外，褪黑激素含量与突变率呈负相关（图S1）。
此外，由 35 S 启动子驱动的ClCOMT1被遗传转化到西瓜愈伤组织中，导致ClCOMT1的过表达（图6A-C）。与非转基因愈伤组织相比，转基因系#1、#2 和#3 中ClCOMT1的转录水平分别诱导了10.7、3.8 和5.6 倍。因此，与野生型愈伤组织相比，#1、#2 和#3 中褪黑激素的含量分别增加了 7.0 倍、2.2 倍和 5.8 倍（图6D）。这些结果表明ClCOMT1在西瓜褪黑激素产生中的直接作用。
3.4 ClCOMT1参与非生物胁迫 通过植物表型和相对电导率评估，外源褪黑激素的应用增强了西瓜对寒冷、干旱和盐胁迫的耐受性（图S2）。暴露于这三种胁迫后，ClCOMT1转录本被诱导 2.1 倍、4.7 倍和 7.0 倍，褪黑激素含量分别增加了 82.1%、41.7% 和 125.9%（图7）。
为了进一步检查ClCOMT1是否赋予植物对非生物胁迫的耐受性，使用pGREEN -ClCOMT1- GFP载体将该基因遗传转化到拟南芥中（图8A）。在转基因植物中检测到ClCOMT1的表达，但在野生型植物中未检测到（图8B）。与野生植物相比，五个转基因株系中的褪黑激素含量增加了 2.3 至 4.1 倍（图8C）。转基因植物对寒冷、渗透胁迫和 NaCl 表现出更高的耐受性（图8D，E）。例如，转基因植物（#4 系）的成活率分别为 77.5%、82.2% 和 79.6%，远高于经过冷处理、甘露醇和 NaCl 处理后的野生植物的 31.3%、53.9% 和 53.8%。. 这些结果表明ClCOMT1是植物对非生物胁迫耐受的正调节因子。
结论 4 随着褪黑激素在植物中的功能被证实，参与褪黑激素合成的关键基因应在更多的植物中进行探索。在本研究中，作者报道了一个在褪黑激素生物合成中起重要作用的西瓜COMT基因 ( ClCOMT1 )。作者还证实，ClCOMT1是植物对非生物胁迫（包括寒冷、干旱和盐度）耐受性的正调节因子。据我们所知，ClCOMT1是第一个从葫芦科植物中克隆的褪黑激素生物合成基因。 原文获取 5 原文链接：https://www./articles/s41438-021-00645-5  END 06 广告 |
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