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编译：秦时明月，编辑：谢衣、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 籽粒大小是籽粒产量的重要组成性状，且经常受到非生物胁迫的威胁。然而，人们对谷物产量和非生物胁迫耐受性的调节机制知之甚少。本研究鉴定了GSA1 (Grain Size and Abiotic stress tolerance 1)，其是一个调节籽粒大小和与代谢流重定向相关的非生物胁迫耐受性的数量性状位点（QTL）。GSA1编码一个UDP葡萄糖基转移酶，它对山奈酚、柚皮素及槲皮素等黄酮类代谢物表现出葡萄糖基转移酶活性。GSA1通过调节细胞增殖和膨胀来调节籽粒大小，而细胞增殖和膨胀受黄酮类物质介导的生长素水平和相关基因表达的调节。GSA1是非生物胁迫下木质素生物合成向类黄酮生物合成转化和类黄酮苷积累的必需因素，其可以保护水稻免受非生物胁迫。过表达GSA1导致水稻籽粒增大和非生物胁迫耐受性增强。本研究的发现对利用代谢流重定向来调节籽粒大小和非生物胁迫耐受性进而促进作物改良提供了重要参考。 论文ID 原名：UDP-glucosyltransferase regulates grain size and abiotic stress tolerance associated with metabolic flux redirection in rice 译名：UDP-葡萄糖基转移酶通过代谢流重定向调节水稻籽粒大小和非生物胁迫耐受性 期刊：Nature Communications IF：12.121 发表时间：2020.05 通讯作者：林鸿宣&单军祥&叶汪薇 通讯作者单位：中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所 实验设计 本研究以非洲水稻品种CG14（O. glaberima）为供体亲本，亚洲水稻品种Wuyunjing（WYJ，O. sativa japonica）为轮回亲本，构建了一套水稻籽粒大小和非生物胁迫相关的回交导入系（CSSLs）。研究人员选择含有GSA1的CSSL，命名为SG48，并多次回交给WYJ。本研究使用了200株BC4F2植株的粒宽、粒长和1000粒重的性状，以及在含有GSA1基因的靶区中7个新设计的分子标记对GSA1基因进行精细定位。之后，研究人员对GSA1基因进行了定量分析以及GSA1基因的核苷酸多态性与自然变异，并从NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14中扩增GSA1序列，构建了超表达与敲除株系，然后进行了组织染色、电镜扫描、生长素与木质素含量测定，并在大肠杆菌中进行了酶活与蛋白表达分析以及转录组分析与广泛靶向代谢组分析。 实验结果 1 GSA1是一个控制水稻籽粒大小的QTL 为了鉴定水稻产量QTL，研究人员用非洲水稻品种CG14和亚洲水稻品种 WYJ构建了一套CSSLs，从中鉴定了多个籽粒大小QTL，并在第3染色体上选择了一个QTL，命名为GSA1，用于进一步的鉴定。GSA1是一个籽粒大小QTL，与1000粒重表型变异的14.5%，粒长表型变异的18.6%，粒宽表型变异的14.1%相关联。 研究人员还构建了一个近等基因系（NILs），发掘出NIL-GSA1CG14和一个等位基因NIL-GSA1WYJ，以进一步研究GSA1基因对籽粒大小和其他农艺性状的影响。与NIL-GSA1WYJ相比，NIL-GSA1CG14的千粒重（-9.29%）、籽粒长度（-3.78%）和籽粒宽度（-4.8%）降低，并且与NIL-GSA1WYJ相比，NIL-GSA1CG14产生的籽粒更多（图1a-d）。然而，在株高、有效穗数、穗长或单株产量方面没有显著差异。这些结果表明，GSA1是一个影响籽粒大小的QTL。 考虑到NIL-GSA1CG14中的较小籽粒，研究人员分析了NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14中的籽粒填充率。NIL-GSA1CG14籽粒的鲜重、干重、长度和宽度明显小于NIL-GSA1WYJ（图1e）。在颖果发育过程中，NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14之间的颖果含水量没有显著差异，表明GSA1参与了干物质积累和颖果发育的调节。 为了克隆GSA1基因，研究人员进行了高分辨率作图，并将GSA1位点缩小到29.47kb区域（图1f）。在这一区域，注释到了5个基因，即三个编码UDP葡萄糖基转移酶（UGT）的基因LOC_Os03g55030、LOC_Os03g55040和LOC_Os03g55050、编码具有同义核苷酸替换的葡萄糖-6脱氢酶基因LOC_Os03g55070和编码功能未知蛋白的LOC_Os03g55034基因。序列比较发现编码UDP葡萄糖基转移酶基因在两个亲本之间具有核苷酸变异，导致LOC_Os03g55040的保守植物二级产物糖基转移酶（PSPG）结构域中349（A349T）位置的氨基酸从丙氨酸替换为苏氨酸，还鉴定到了两种同义核苷酸替换和导致氨基酸替换（A246V）的另一种核苷酸变异（图1f）。进一步的蛋白质序列比对显示，A349在大多数单子叶植物中是保守的，GSA1CG14是GSA1的一个罕见等位基因。对禾本科、芸苔科和豆科植物GSA1及其同系物的系统发育分析表明，单子叶植物和双子叶植物GSA1序列分为两个分支，表明GSA1在单子叶植物和双子叶植物进化分化之前就已存在。此外，研究人员还比较了GSA1WYJ和GSA1CG14的启动子区域，发现GSA1CG14启动子区域的保守基序中存在自然变异；这些自然变异可能影响转录因子与这些基序的结合和GSA1启动子的激活。因此，LOC_Os03g55040是GSA1位点最可能的候选基因。 为了进一步证实LOC_Os03g55040与GSA1相对应，研究人员在WYJ背景下过表达GSA1WYJ，随后观察到转基因系中千粒重、粒长和粒宽明显增加（图1g-j）。相比之下，使用CRISPR/Cas9系统敲除GSA1WYJ并在WYJ背景中过表达GSA1CG14导致籽粒更小。然后，研究人员进行了一个基因互补试验，其中来自WYJ包含假定的启动子区、整个ORF和GSA1的3′非翻译区的DNA片段导入NIL-GSA1CG14。含有全长GSA1基因的NIL-GSA1CG14转基因系在千粒重、粒长和粒宽方面表现为NIL-GSA1WYJ表型。此外，使用CRISPR/Cas9系统产生的另外两个UGT基因LOC_Os03g55030和LOC_Os03g55050的敲除系在千粒重、粒长和粒宽方面与WYJ相比没有显著差异。此外，在NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14之间，LOC_Os03g55030和LOC_Os03g55050的表达水平没有显著差异。
2 GSA1调节细胞增殖和细胞膨胀 研究人员检测了GSA1的组织特异性表达模式，发现GSA1在各种生殖器官和营养器官中广泛表达，在小穗壳和颖果中表达水平较高，这与控制小穗发育的作用一致。此外，GSA1在NIL-GSA1CG14中的表达水平高于NIL-GSA1WYJ，尤其是在小穗壳中（图2a）。因此，研究人员推测GSA1CG14是一个功能较弱的等位基因。 由于NIL-GSA1CG14表现出较小的籽粒大小，研究人员研究了成熟和幼穗中的细胞数量和细胞大小。与NIL-GSA1WYJ相比，NIL-GSA1CG14成熟粒外表皮细胞的粒宽方向的细胞长度和细胞数量显著减少，粒长方向的细胞宽度和细胞数量略有减少（图2b-f）。对孕穗期NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14小穗壳中部的横截面的观察结果显示，NIL-GSA1CG14的外实质细胞明显少于NIL-GSA1WYJ。对内表皮细胞的观察表明，与NIL-GSA1WYJ相比，NIL-GSA1CG14小穗壳细胞的平均长度和宽度显著减少。这些结果表明，GSA1是一个通过调控细胞增殖和细胞膨胀来精细调控小穗发育的QTL。 考虑到GSA1负责细胞增殖和细胞膨胀，并调节小穗发育，研究人员分析了NIL-GSA1CG14中局部生长素（IAA）生物合成、信号和运输是否受到干扰。年幼的NIL-GSA1CG14颖果和圆锥花序的水平显著低于NIL-GSA1WYJ（图2g），表明在小穗发育过程中，NIL-GSA1CG14的生长素生物合成量比NIL-GSA1WYJ少。此外，RNA-seq数据表明，NIL-GSA1CG14幼穗中生长素生物合成、信号传递和代谢相关的大量基因的表达水平较NIL-GSA1WYJ显著降低（图2h）。为了验证RNA-seq的结果，研究人员用NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼穗进行了qRT-PCR分析。研究人员发现NIL-GSA1CG14中编码IAA生物合成成分、生长素转运蛋白和生长素应答因子的基因的相对表达水平明显低于NIL-GSA1WYJ（图2i）。有趣的是，在NIL-GSA1CG14中，通过调节局部生长素生物合成来控制籽粒大小的TSG1的表达水平显著降低；TSG1同源基因OsTAR1、OsTARL1和OsTARL2的表达水平也显著降低（图2i）。因此，研究人员认为GSA1参与了小穗发育过程中细胞增殖和细胞膨胀的调节，并间接影响生长素水平和生长素相关基因的表达。 图2 GSA1通过影响细胞增殖和细胞膨胀来控制小穗大小。（a）qRT-PCR表明GSA1在NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14叶片、根系、茎秆节、茎秆、幼穗、小穗壳和颖果中的相对表达水平。（b）成熟期NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14小穗壳外表皮细胞的扫描电镜观察。（c-f）NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14小穗壳外表皮细胞长度、粒长方向细胞数和粒宽方向细胞数的比较。（g）NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14孕穗期颖果和幼穗内源IAA水平的比较。（h）利用RNA-seq测定的NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼穗生长素相关基因相对表达水平的聚类热图。（i）qRT-PCR测定的NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼穗生长素相关基因的相对表达水平。 3 GSA1调节苯丙酸稳态 苯丙酸途径会产生大量的次生代谢产物如类黄酮等。GSA1基因被预测编码一个包含PSPG结构域的UDP葡萄糖基转移酶（UGT83A1）。为了进一步研究GSA1的作用和潜在的受体，研究人员进行了广泛靶向代谢组分析。如图3a所示，NIL-GSA1CG14的幼穗、小穗壳和颖果中黄酮苷的相对含量显著低于NIL-GSA1WYJ，表明NIL-GSA1CG14中黄酮苷的生物合成受到干扰。此外，NIL-GSA1CG14穗中黄酮类化合物如山奈酚、柚皮素及槲皮素的含量明显较高，而黄酮苷类化合物的含量明显较低（图3b），说明黄酮苷类化合物的生物合成需要GSA1。此外，NIL-GSA1CG14幼年颖果中的单甲酚的含量高于NIL-GSA1WYJ（图3b），而小穗壳和成熟颖果中的木质素的含量显著低于NIL-GSA1WYJ（图3c），表明GSA1也有助于木质素的生物合成。然后，研究人员检测了与苯丙酸途径相关基因的表达水平。如图3d所示，与NIL-GSA1CG14相比，NIL-GSA1WYJ的幼穗中参与苯丙酸途径、木质素途径、类黄酮生物合成和花青素生物合成的基因表达水平明显降低。 图3 NIL-GSA1CG14中类黄酮苷和苯丙酸途径的改变。（a）根据广靶代谢组学对NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14的幼颖果、幼穗、成熟颖果和成熟小穗壳中黄酮苷的相对含量进行的聚类热图分析。（b）NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼穗中黄酮和黄酮苷的相对含量和幼穗中单甲酚的相对含量。（c）NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14成熟小穗壳和成熟颖果的木质素含量。（d）NIL-GSA1WYJ和 NIL-GSA1CG14幼穗孕穗期中苯丙酸途径、木质素特异途径、类黄酮生物合成和花青素生物合成基因的相对表达水平。 4 GSA1具有广谱葡萄糖基转移酶活性 上述代谢组数据显示，NIL-GSA1CG14中的山奈酚、柚皮素、槲皮素和单甲酚含量高于NIL-GSA1WYJ，而柚皮苷-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷和木质素含量显著低于NIL-GSA1WYJ。因此，研究人员分析了GSA1是否催化这些黄酮类化合物和单核苷酸的糖基化，以及PSPG和A246V内的A349T替换是否导致葡萄糖基转移酶活性降低。 酶反应产物的高效液相色谱（HPLC）分析表明，山奈酚（图4a）、槲皮素（图4b）和柚皮素被GSA1糖基化。此外，在GSA1CG14介导的反应中产生的K7G、Q7G和N7G的峰面积明显小于GSA1WYJ产生的峰面积（图4c、d），进一步支持GSA1CG14是一种功能较弱的类黄酮葡萄糖基转移酶的假设。为了进一步验证GSA1反应产物的性质，采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对假定的K7G、Q7G和N7G产物进行了分析（图4e、f）。结果表明，类黄酮的葡萄糖基化需要GSA1。 为了进一步研究GSA1是否以单核苷酸作为受体，研究人员对GSA1介导的体外单核苷酸反应产物进行了HPLC分析。研究人员发现GSA1催化对松柏醇、对香豆醇及芥子醇的葡萄糖基化反应（图4g、h）。此外，由GSA1WYJ生产的松柏醇糖苷、对香豆醇糖苷及芥子醇糖苷的峰面积明显大于GSA1CG14（图4i、j），暗示PSPG内A349T和A246V的替换导致GSA1CG14葡萄糖基转移酶活性减弱。为了进一步证实单甲酚的糖基化，用LC-MS对GSA1WYJ的催化产物进行了分析，发现GSA1WYJ催化产物出现了对应于甲烷酸加合物的优势离子峰（图4k、l），与预测的松柏醇糖苷、对香豆醇糖苷及芥子醇糖苷的结果吻合较好。 为了鉴定导致GSA1WYJ和GSA1CG14活性差异的关键氨基酸，研究人员异源表达了突变型GSA1A246V以及GSA1A349T的大肠杆菌。高效液相色谱分析表明，GSA1A246V的葡萄糖基转移酶活性与GSA1WYJ相当，而GSA1A349T的葡萄糖基转移酶活性与GSA1CG14相当。这些结果表明，在保守的PSPG结构域中A349T的丙氨酸对GSA1的葡萄糖基转移酶活性至关重要。之后，研究人员选择山奈酚作为糖受体，进行了GSA1的动力学分析。结果表明，GSA1WYJ对山奈酚的Km值与GSA1CG14无明显差异，而GSA1WYJ对UDP葡萄糖的Km值远低于GSA1CG14。
5 GSA1调节非生物胁迫下的代谢流重定向 鉴于GSA1在调节类黄酮糖苷结构中起着重要作用，研究人员分析了GSA1是否参与水稻对非生物胁迫的耐受。与WYJ幼苗相比，GSA1WYJ过表达的幼苗具有更好的耐盐性、耐热性和耐旱性（图5a-c），并且在非生物胁迫下提高了存活率（图5d-f）。然而，与NIL-GSA1WYJ相比，GSA1CG14幼苗对非生物胁迫表现出更高的敏感性。与WYJ幼苗相比，过表达GSA1CG14和GSA1敲除系KO-GSA1的幼苗表现出耐盐性降低。互补转基因系在NaCl处理下的存活率与NIL-GSA1WYJ一致。此外，NaCl处理后，NIL-GSA1WYJ和NIL- GSA1CG14中GSA1的表达水平更高，NIL-GSA1WYJ的增加大于NIL- GSA1CG14，这意味着GSA1是由非生物胁迫诱导的。综上所述，这些结果强烈表明GSA1在非生物胁迫耐受中直接起作用。 为了进一步研究GSA1在调控非生物胁迫耐受的代谢过程中的作用，研究人员检测了盐胁迫和正常条件下苯丙酸途径相关基因的表达水平。在NaCl处理下，WYJ和Pro35S:GSA1WYJ种子和正常条件下以及NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14（图5g）中OsC4H显著上调，表明在盐胁迫下GSA1诱导了苯丙酸途径。然而，NIL-GSA1CG14中OsC4H表达水平的增加明显小于NIL-GSA1WYJ，并且KO-GSA1中OsC4H表达水平在正常条件和NaCl处理之间没有差异，提示GSA1在非生物胁迫中诱导苯丙酸途径起重要作用。另外，在盐胁迫下，WYJ和Pro35S:GSA1WYJ以及NIL-GSA1WYJ中OsCAD7的表达水平显著降低，而在盐胁迫和正常条件下，KO-GSA1和NIL-GSA1CG14幼苗中OsCAD7的表达没有明显差异（图5g）。与NIL-GSA1WYJ相比，互补转基因系在这些基因的表达水平上没有显著差异。综上所述，这些结果表明GSA1参与了非生物胁迫下木质素途径的下调。 然而，在盐胁迫下，WYJ和Pro35S: GSA1WYJ中OsC1的表达水平明显高于正常条件下。OsC1编码调节叶片和小穗中花青素生物合成的R2R3-MYB转录因子。编码花青素合成酶40的OsANS在盐胁迫下在WYJ和Pro35S: GSA1WYJ和NIL-GSA1WYJ以及NIL- GSA1CG14幼苗中的表达明显高于正常条件下的表达（图5g），表明包括花青素在内的黄酮类化合物的生物合成受到非生物胁迫的极大调控。与OsC4H相似，Pro35S中OsC1和OsANS表达水平的增加；GSA1WYJ明显大于WYJ；NIL-GSA1WYJ明显大于NIL-GSA1CG14；WYJ明显大于KO-GSA1（图5g）。与NIL-GSA1WYJ相比，互补转基因系在这些基因的表达水平上没有显著差异。这些数据表明，GSA1对非生物胁迫下黄酮类化合物（包括花青素）的生物合成具有重要的上调作用。总之，在非生物胁迫下，GSA1是激活苯丙酸途径和类黄酮生物合成以及下调木质素途径所必需的。 为了研究代谢流的重定向是否与非生物胁迫耐受有关，研究人员在正常和盐胁迫条件下对NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼苗进行了广靶代谢组分析。在盐胁迫下，NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼苗的某些苯丙酸代谢产物的相对含量明显增加，与苯丙酸途径和木质素途径相关基因的表达水平一致，而其他苯丙醇代谢物的相对水平，特别是单甲酚则大大降低。有趣的是，在这些下调的苯丙醇代谢物中，与NIL-GSA1WYJ相比，NIL-GSA1CG14幼苗的降低程度明显较小，一些苯丙醇代谢物甚至在NIL-GSA1CG14中上调，包括对香豆醇和芥子醇（图5h）。此外，在盐胁迫下，包括木质素途径代谢物在内的苯丙酸代谢物在GSA1WYJ中的下调更为明显。这些结果表明，GSA1在盐胁迫下调控木质素途径代谢流起着关键作用。相反，在盐胁迫下，NIL-GSA1WYJ种子中大量糖苷类黄酮的相对含量明显增加，而NIL-GSA1CG14幼苗中这些类黄酮的含量没有GSA1WYJ中增加的多（图5i），这意味着NIL-GSA1CG14幼苗的代谢流重定向被破坏。综上所述，研究人员认为GSA1在诱导苯丙酸途径和类黄酮生物合成途径，以及在响应非生物胁迫中将代谢流从木质素途径转向类黄酮生物合成途径起着关键作用（图6a、b）。 图5 GSA1调节与代谢流重定向相关的非生物胁迫耐受性。（a-c）将14日龄WYJ和过表达系的幼苗转移到120mM NaCl中7天、42℃下26小时或16% PEG8000中14天，并恢复14天后的表型。（d-f）NaCl处理、高温处理和PEG处理后WYJ和过表达14日龄幼苗的相对存活率。（g）qRT-PCR测定的NaCl处理前后WYJ和Pro35S:GSA1WYJ幼苗中OsC4H、OsCAD7、OsC1和OsANS的相对表达水平。（h-i）根据广靶代谢组数据测定的NIL-GSA1WYJ和NIL-GSA1CG14幼苗经NaCl处理后苯丙酸和类黄酮相对水平的聚类热图。 图6 GSA1在水稻籽粒大小调控和非生物胁迫中作用的工作模型。（a）在正常条件下，GSA1WYJ催化单甲酚的糖基化，促进木质素生物合成，这是细胞增殖和细胞膨胀所必需的。（b）在非生物胁迫（盐胁迫、干旱胁迫或高温胁迫）下，GSA1WYJ的代谢流重定向于花青素和黄酮苷的生物合成，增强对非生物胁迫的耐受性。 结论 本研究通过图位克隆的方法定位克隆到一个同时调控水稻粒型与抗逆性的QTL GSA1。过表达GSA1增加水稻籽粒大小和粒重，同时提高水稻对高盐、干旱及高温的抗性。核苷酸多态性分析显示，GSA1在非洲野生稻驯化为非洲栽培稻以及亚洲野生稻驯化为粳稻的过程中受到人工选择。GSA1编码一个水稻糖基转移酶UGT83A1，体外实验证实GSA1具有广谱的糖基转移酶活性，以尿苷二磷酸UDP为糖基供体，以山奈酚、柚皮素及槲皮素等黄酮类代谢物为糖基转移受体，最终通过影响细胞分裂和细胞增殖而调控水稻粒型。同时GSA1也可以将松柏醇、对香豆醇及芥子醇等木质素单体作为糖基转移受体，进而调控木质素含量，这可能也是调控水稻粒型的原因。GSA1CG14（非洲稻位点）中位于 PSPG保守结构域内的氨基酸变异A349T导致GSA1CG14结合UDP的能力比GSA1WYJ（亚洲稻位点）明显下降，糖基转移酶活性显著降低，而位于非保守域的氨基酸变异则对底物结合及糖基转移酶活性无影响。进一步研究表明，逆境胁迫下GSA1参与代谢流从木质素合成途径重新定向于黄酮糖苷合成途径，木质素合成途径下调而黄酮糖苷包括花青素合成相关通路上调，导致水稻抗逆性的增强。过量表达GSA1WYJ显著增加逆境胁迫下黄酮糖苷及花青素的含量，引起水稻抗逆性增强。而敲除GSA1造成逆境下代谢流重新定向的紊乱，黄酮糖苷合成受阻，水稻抗逆性减弱。 评论 水稻是世界重要的粮食作物，产量受到很多因素的影响。其中，粒型是影响水稻产量的主要因素之一，同时水稻产量经常遭受干旱、高盐和高温等非生物胁迫的影响，如何提高水稻产量的同时增强水稻抗逆性是对科研人员和育种工作者的挑战课题。植物需不断调整体内代谢流以适应不同发育时期和生长环境，但在作物中对此了解甚少。该研究揭示了糖基转移酶通过调控代谢流重新定向进而同时调控水稻粒型与抗逆性的新机制，为培育高产高抗作物新品种提供了有价值的基因资源。 原文网址：https:///10.1038/s41467-020-16403-5 |
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