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CRISPR-Cas系统是原核生物抵御病毒的一种获得性免疫系统。目前基于CRISPR-Cas的基因编辑技术已广泛应用于基因校正，遗传育种、新药开发、动物模型构建、转录调控以及分子诊断等各领域。被誉为在后基因组时代开创了遗传疾病精准治疗的新时代。 CRISPR-Cas系统可以按照效应物是多亚基或单亚基分为Class I和Class II两大家族（一型和二型）。单亚基效应物的Class II家族熟知的蛋白包括大家常用的Cas9, Cas12, Cas13等。Class I家族包括Cascade-Cas3, Csm, Cmr复合物等等。但是这些系统不管是哪类，都是sgRNA靶向和激活的核酸酶，对靶向的DNA或RNA进行切割。目前大家所使用的CRISPR-Cas技术都是围绕sgRNA靶向和RNA guided核酸酶展开的。 2022年8月25日，康奈尔大学的可爱龙实验室联合荷兰荷兰代尔夫特理工大学Stan J.J Brouns实验室在Science杂志以长文形式发表了题为Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA activated protease 的工作，全面解析了一种全新的CRISPR偶联的蛋白酶新系统（Craspase, CRISPR associated Caspase）的工作机制。简言之，这是一个gRNA引导的并且受到靶向RNA激活的蛋白酶系统，该蛋白酶受到激活之后可以对天然的蛋白底物以及工程化的多肽片段进行特异切割，展现出巨大的应用潜力。  CRISPR-Cas系统分为两大家族Class I和Class II。Class I又可以细分为Type I, III, IV三大类，均为多亚基效应物系统【1, 2】。近些年，研究人员从type III家族内追踪出一种全新的比较数量小众的系统命名为type III-E系统。该系统有着三大特别突出的特性：第一，该系统虽然出自多亚基的type III系统，但是其所有的亚基却全部以融合蛋白的方式串联成一个巨大的单亚基（1300-1900个氨基酸），并命名为gRAMP (Giant Repeat Associated Mysterious Protein，重复序列相关的巨大的神奇蛋白)；第二，gRAMP蛋白是引导RNA介导靶向RNA的CRISPR-Cas系统，其拥有两个RNase切割位点，可以对靶向的RNA切割成三段；第三，该CRISPR系统附近有一个命名为TPR-CHAT的蛋白酶，该蛋白酶CHAT和真核生物焦亡激活酶Caspase有着高度同源性，并且该蛋白酶已经被证实和gRAMP能相互作用形成复合物(1)。就单单这几个特性，足够使该系统展现出特别的吸引力。首先多亚基串联成单个亚基，在表达和组装上会更加高效，有潜力体现单亚基系统（比如Cas9）递送优势；另外该系统已经被证实在靶向RNA之后没有旁切活性，使其在细胞内的毒性大大降低，未来有巨大的潜力，与Cas13一起成为RNA编辑器的承担者；最后，该系统有着天然偶联的蛋白酶系统，如果被证明其具体受到CRISPR-Cas系统调控的蛋白酶活性，未来就有可能开发出众多的和蛋白定向降解的新工具，前景十分巨大。然后该系统的RNA靶向和目标RNA是否能激活蛋白酶，蛋白酶的底物是什么等问题还是完全未知的，因此亟待其全面机制的解析（图1）。  图1：Type III-E CRISPR-蛋白酶偶联系统Craspase。A.系统进化树分类，typeIII-E来源于一支小众的进化方向；B上：CRISPR-Cas系统gRAMP和Caspase蛋白酶基因座。下：Craspase猜想的工作模型，gRAMP靶向RNA之后激活Craspase-like蛋白酶TPR-CHAT，使其切割蛋白底物，最终诱导细胞死亡。 该项工作由美国康奈尔大学可爱龙实验室的胡纯一博士领衔，首先通过冷冻电镜对gRAMP多重功能状态的捕捉，发现了gRAMP的一段loop序列，命名为gating loop（门控环，377-412位氨基酸序列）对靶向RNA的序列筛选具有check point的功能。具体讲就是目标RNA的靶向是从guide RNA的3'→ 5'方向进行互补配对，门控环会对最后seed区(guide RNA的第1-4位碱基)的碱基互补序列进行“检验”，如果靶向的RNA与最后seed区是互补配对的，那么门控环允许其通过大门，形成guide RNA-target RNA完全互补配对的双链结构，只有形成该结构，才会激活gRAMP的两个RNase酶切位点,进行切割。这项发现合理解释了gRAMP通过门控环，对“最后一里路”的seed区互补配对进行检测，以此来规避脱靶的机制（如图2）。  图2：Type III-E CRISPR-蛋白酶偶联系统中gRAMP避免脱靶的机制。A.不同状态结构的比较。左：静息状态下门控环处于关闭状态阻挡seed区碱基配对；中：正确的目标RNA结合之后门控环开发；右：结构叠加。B. gRAMP靶向RNA以及切割的机制模式图。目标RNA的靶向配对从guide RNA的3'开始进行，门控环对最后四个碱基的配对进行 “检测” ，若全部互补配对，则会打开门控，完成全部的互补配对，最终实现RNA切割。 这个系统最重要的问题是，gRAMP靶向RNA之后，能不能激活蛋白酶？换言之，这个蛋白酶真的能像设想的那样受到CRISPR-Cas系统的调控并被靶向的RNA激活码？怀着这个终极问题，胡纯一博士再对Craspase静息，靶向“自我”RNA（Matching PFS target），靶向“非我”RNA（Non-matching PFS target）三种不同状态进行了高分辨的结构重构。比较惊喜的发现，在Craspase静息状态和靶向“自我”RNA时，其蛋白酶TPR-CHAT并未发生构象改变，而当Craspase靶向了“非我”序列的RNA时，这种带有特殊“标记”的RNA（guide序列自我的两个碱基不能互补，non protospacer flanking sequence (PFS) matching）会与蛋白酶亚基上的一段“开关螺旋”（switch helix）产生一个空间冲突，迫使开关螺旋进行结构重排并发生巨大的构象改变（图3）。  图3：Craspase静息和靶向不同RNA的结构图。A.不同状态的冷冻电镜密度图。左：静息Craspase；中：Craspase靶向“自我”序列RNA（matching PFS target）；右：Craspase靶向“非我”序列RNA (non-matching PFS target)。B. Craspase蛋白酶 “开关螺旋” 在以上三种状态下的构象展示。 通过原子分辨率的结构比较，团队发现和静息状态比，靶向“非我”RNA之后，蛋白酶“开关螺旋”的重排和构象改变，会进一步推动蛋白酶活性口袋的结构变化，导致催化二联体组氨酸-半胱氨酸的距离从6.6埃缩小到3.3埃，达到蛋白酶激活状态（如图4和微视频1）。  图4：Craspase蛋白酶激活示意图。左：静息状态下CHAT蛋白酶口袋组氨酸-半胱氨酸催化二联体距离为6.6埃；中：Craspase靶向“自我”序列RNA（matching PFS target）时，CHAT蛋白酶组氨酸-半胱氨酸二联体距离为5.2埃并且没有口袋；右：Craspase靶向“非我”序列RNA (non-matching PFS target)时，CHAT蛋白酶组氨酸-半胱氨酸二联体距离为3.3埃，并产生结合口袋，处于蛋白酶激活状态。 00:56 微视频1：Craspase蛋白酶激活时构象转变过程模拟。 这些研究表明，该系统的蛋白酶活性调控十分严谨，需要同时满足至少三个条件。第一，目标RNA必须和guide RNA的引导区完全互补配对（至少18个碱基）。第二，guide RNA 5' tag位置的PFS区的前两位（-1和-2位置碱基）必须与目标RNA错配。与靶向互补配对。第三，靶向RNA的3'端除去前两位不能错配的碱基之外还需要额外至少3个碱基用来推动蛋白酶的开关螺旋进行重排变构，从而激活蛋白酶（图5）。 最后一个问题，这个蛋白酶的底物是什么？团队通过体内体外筛选，成功找到该Craspase系统蛋白酶底物，名为Csx30。该Craspase系统在结合了“非我”RNA之后能快速特异性地对该蛋白底物进行切割，生产一大一小两个亚基，而其他的“自我序列”，哪怕能与guide RNA进行互补配对也无法激活蛋白酶。因此这个结果从生化水平非常确切地验证了该蛋白酶系统受到CRISPR系统的精准调控，最后成为靶向RNA激活的蛋白酶。此外，该团队还从结构出发，设计出了一些多肽序列，在体外也能在靶向RNA激活的情况下实现蛋白酶的精准切割。这在一定程度上暗示了该系统非常有潜力成为蛋白定向降解的新工具（图5），前景十分广大。  图5：Craspase蛋白酶激活并且切割蛋白底物。A. Craspase系统蛋白酶激活模式。需要同时至少满足RNA靶向以及PFS区前两位碱基错配。B. Craspase系统切割Csx30需要RNA激活。C. Craspase系统切割Csx30严格通过PFS区的检测来区分自我和非我序列，避免脱靶切割。D.设计工程化多肽可被Craspase系统靶向切割。 值得一提的是，在8月18和8月22日，bioRxiv预印本网站上，分别上传了日本东京大学Hiroshi Nishimasu、美国麻省理工大学 Jonathan S. Gootenberg团队合作题为RNA-triggered protein cleavage and cell death by the RNA-guided type III-E CRISPR-Cas nuclease-protease complex ，以及北京化工大学冯越教授与清华大学杨茂君教授合作题为Structural and functional insights into the type III-E CRISPR-Cas immunity 的两篇论文（如下图）。该两篇论文阐述了与可爱龙、Stan J.J Brouns实验室发表的这篇Science论文一致的观点。分别在Desulfonema ishimotonii和Candidatus “Scalindua brodae”（与本篇Science论文使用了同一物种）物种中都观察到了一致的现象。在PFS non-matching的RNA靶向之后，都会激活Caspase-like蛋白酶并切割蛋白底物Csx30。并且这两篇论文都同时明确证实了Csx30在受到Craspase蛋白酶切割之后会诱导细胞死亡。 总之，上述几篇论文，都同时阐述了Craspase系统是guide RNA引导的，并且受到靶向RNA激活的蛋白酶系统，该蛋白激活之后会切割蛋白底物，诱导细胞死亡。在未来，若在蛋白酶特异性上展开拳脚，有望翻开蛋白定向降解的新篇章。   专家点评  孔祥峰（博后/研究员 辉大基因）、杨辉（辉大基因、中科院脑智越创新中心） 细菌的CRIPSR-Cas系统一般通过直接切割入侵遗传物质（包括DNA和RNA）或者产生次级信号分子激活辅助核酸酶来发挥适应性免疫防御功能。Type III CRISPR-Cas系统兼具上述两种能力，是目前已知最为复杂精密的CRISPR-Cas系统【3】。Type III CRISPR-Cas系统通常有多个效应蛋白协同发挥RNA靶向及切割的功能。Makarova等在2019年通过计算分析首次报导了type III-E CRISPR-Cas系统，该系统由一个融合了4个Cas7结构域、1个Cas11结构域和BID结构域的单一效应蛋白（gRAMP）组成【4】。Gootenberg团队和Brouns团队2021年证明Type III-E CRISPR-Cas系统具备RNA靶向切割的功能(Science | 揭秘gRAMP CRISPR-Cas效应蛋白实现适应性免疫的新机制;Nature | 低毒性！无旁切活性的新型RNA编辑工具Cas7-11)，并且没有RNA旁切效应（collateral RNA damage）【1,2】，是一个特异性很高的RNA编辑工具。同样作为RNA靶向切割的CRISPR-Cas13系统，天然具备很强的RNA旁切效应，因此使其具有较高的细胞毒性而限制了Cas13系统的进一步应用，不过近期我们通过蛋白定向改造进化，很好地消除了Cas13系统的RNA旁切效应(NBT｜杨辉团队开发出特异性更高安全性更好的高保真版Cas13系统)【7】。 Type III CRISPR-Cas基因座上除了CRISPR簇及效应蛋白外通常还有一些辅助蛋白（如能被次级信号分子cOA激活的非特异性核酸酶Csm6/Csx1）的表达用于下游信号的激活等。在大部分type III-E系统中都发现了TPR-CHAT。TPR-CHAT是一个N端包含TPR重复结构域的caspase类似蛋白酶，它能和gRAMP形成很稳定的复合体——Craspase。Kranzusch团队2022年Science文章报导了细菌体内caspase类似蛋白酶激活gasdermin介导细胞程序性死亡（PCD）的机制，这和人类细胞内caspase-gasdermin介导的炎症信号传导抵御病原体和癌症的机制类似（Science | 细菌中Gasdermins蛋白揭开细胞死亡的进化起源）。这些发现暗示Craspase可能是细菌体内CRIPSR RNA引导的蛋白酶，介导一种之前未被报导的“弃车保帅”自杀机制用于帮助抵御细菌噬菌体的侵染。但是，Craspase的具体功能及其机制还不是很清楚，需要有高分辨率的结构生物学证据来佐证。 可爱龙团队和Brouns团队合作首次报道了3.81埃静息态、3.65埃PFS non-matching RNA结合态、3.76埃PFS matching RNA结合态以及3.62埃RNA切割后的高分辨率gRAMP结构，此外他们还解析了Craspase的结构，得到了静息态、PFS non-matching / matching RNA结合态的高分辨率结构。该工作详细阐明gRAMP的RNA靶向切割机制；确认Craspase是一个CRISPR RNA引导的蛋白酶系统，细菌体内Csx30是其天然的底物；通过高分辨率结构解析发现Craspase的蛋白酶活性受到严格调控：当Craspase靶向PFS non-matching RNA（即外源入侵RNA）时蛋白构象发生改变，激活蛋白酶活性，该蛋白酶活性又再靶向RNA切割完成后被关闭，从而实现对蛋白酶活性的严格调控。 总之，该工作详述了gRAMP和Craspase的作用机制，为后续gRAMP介导的RNA编辑工具及Craspase介导的可调控、选择性激活的蛋白酶系统的开发及优化提供了分子水平的理论依据。期待后续工作检测Craspase在真核生物系统尤其是哺乳动物细胞内的活性，探究其用于帮助抵御病原体侵染或者辅助癌症治疗的可能性。原文链接：http:///10.1126/science.add5064 参考文献 1. van Beljouw, S.P.B., Haagsma, A.C., Rodriguez-Molina, A., van den Berg, D.F., Vink, J.N.A. and Brouns, S.J.J. (2021) The gRAMP CRISPR-Cas effector is an RNA endonuclease complexed with a caspase-like peptidase. Science, 373, 1349-1353.2. Ozcan, A., Krajeski, R., Ioannidi, E., Lee, B., Gardner, A., Makarova, K.S., Koonin, E.V., Abudayyeh, O.O. and Gootenberg, J.S. (2021) Programmable RNA targeting with the single-protein CRISPR effector Cas7-11. Nature, 597, 720-725. 3. Molina, R., Sofos, N. & Montoya, G. Structural basis of CRISPR-Cas Type III prokaryotic defence systems. Curr Opin Struct Biol 65, 119-129 (2020). 4. Makarova, K.S. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat Rev Microbiol 18, 67-83 (2020). 5. Tong, H. et al. High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects. Nat Biotechnol (2022). |
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