染色质空间构象追踪高阶玩法：3D基因组和核组成像

基因组DNA在细胞核中的空间组织控制着基因组的基本功能，包括基因表达调控、DNA复制、突变、修复和重组，并在从发育到疾病的许多生物医学过程中起着至关重要的作用。为了表征基因组的空间组织，基于测序的高通量染色体构象捕获(high-throughput染色体构象捕获)技术捕获了基因组区域之间的接触，并导致了一系列基因组结构的基本发现，如AB区交换和拓扑关联域(TADs) ，以及允许全基因组分析启动子增强子相互作用。传统的DNA FISH不能系统地揭示复杂的染色质折叠路径。为了解决这一问题，2016年引入了一种高度复用的DNA FISH技术，后来被称为染色质示踪，该技术可以在单个细胞中沿着单个染色体直接示踪染色质的3D折叠路径。此后，染色质示踪在不同的基因组长度尺度上被应用于各种细胞类型和模式生物，包括果蝇胚胎、秀丽隐杆线虫[7]和哺乳动物组织。它还与多路RNA和蛋白质成像相结合，揭示染色质折叠变化的功能后果，细胞类型特异性组织，以及多面核组结构，包括同一细胞中的核仁和层状连接。这些进展为3D基因组和核组提供了丰富的信息和新的见解。

正确的3D基因组组织对于基因组的正常运作至关重要，基于图像的3D基因组学技术的最新进展已经能够在几个重要生物系统的单细胞中直接追踪染色质折叠和核组结构的多重成像。在这里，本文将讨论这些进展以及基于图像的 3D 基因组学的未来方向。

文献名称：Chromatin Tracing: Imaging 3D Genome and Nucleome

期刊：Trends Cell Biol 16.041

原文链接：https://www.ncbi.nlm./pmc/articles/PMC8094612/ 

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研究内容

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1、染色质追踪和基于图像的3D基因组学的基本概念

染色质追踪可精确定位沿同一染色体的众多基因组位点的3D位置，并根据其基因组身份连接3D位置以揭示染色质折叠路径。传统的DNA FISH不允许染色质追踪，因为：(i) 当许多基因组位点以相同（或少数）荧光颜色同时可视化时，无法区分该位点的基因组身份；(ii) 来自许多基因组位点的荧光通常由于衍射而连接，并且不允许解析单个位点（图1A）。为了解决这些问题，染色质追踪使用了顺序成像和重建程序。首先，初级FISH探针库与所有感兴趣的基因组位点杂交。接下来，荧光标记的二级FISH探针依次杂交到与单个基因组位点相关的初级探针上的独特悬垂区域。通过这种方式，每个基因组位点都被可视化为3D中的衍射极限点，这允许以纳米级精度拟合其中心位置（图1B）。在下一轮顺序杂交之前成像后消除来自每个位点的荧光（图1C）。最后，成像基因组位点的中心位置根据其沿染色体的基因组身份进行连接，以重建有效的超分辨染色质3D折叠路径（图1D）。

图A 传统的 DNA 荧光原位杂交 (FISH) 无法区分和解析同一染色质上的许多基因组位点。

图 B、C在染色质追踪中，初级 FISH 探针与所有感兴趣的基因组位点杂交。然后染料标记的二级 FISH 探针有助于将基因组位点顺序可视化为单个衍射限制点，其中心可以以纳米级精度精确定位。显示了确定轨迹 1 (B) 和轨迹 3 (C) 的过程。

图D 在所有基因座被可视化和精确定位后，它们的中心位置根据它们的基因组身份链接以重建染色质轨迹。

图1. 染色质追踪的概念

2、不同长度尺度和不同生物体中的染色质示踪

染色质追踪首先在人类细胞培养中通过对数十TAD 的中心位置进行成像，并以百万碱基分辨率解析这些染色体的折叠，在人类细胞培养中的TAD到染色体规模上得到证实。通过这项技术，工作发现先前提出的分形球体模型无法大规模描述染色体组织；A和B区室是空间隔离的，单个染色体拷贝中的稳定结构；并且活跃和不活跃的 X 染色体采用截然不同的折叠方案。

为了在亚TAD尺度上可视化染色质结构，染色质追踪的基因组分辨率增加到30 kb，这导致在培养的人类细胞的单染色体中鉴定出高度变异的TAD样结构。引人注目的是，TAD样结构的维持独立于黏连蛋白，黏连蛋白是建立环状TAD的重要组成部分。另一项亚TAD尺度染色质追踪工作表明，母本和父本同源染色体在这个尺度上以不同的方式组织。

最近，染色质追踪已应用于模式生物的组织。在果蝇胚胎中，一项工作追踪了双胸复合位点的构象，基因组分辨率为2-10 kb，并检测到不同片段中不同的启动子-增强子相互作用。另一项工作追踪了果蝇胚胎合子基因组激活过程中染色质构象的变化，分辨率约为10-kb。染色质追踪也应用于秀丽隐杆线虫胚胎，并揭示了秀丽隐杆线虫的早期胚胎染色体采用了一种非常规的杠铃状结构，由层板关联促进。最近，染色质追踪适用于小鼠组织切片，并以多尺度方式展示了从 5 kb 到整个染色体的四个数量级的基因组长度，识别了小鼠中启动子-增强子相互作用、TAD、区室和染色体区域的从头组织胎肝。

最近的进展还增加了染色质追踪的基因组覆盖率和通量。在这里，一个关键概念是为每个基因组位点分配一个独特的组合条形码，该条形码通过顺序成像进行解码。最近的一项工作通过原位测序检测了条形码，并在人类细胞培养中的6 条染色体上显示了总共36个基因组位点。最近的一项工作追踪了细胞培养中所有人类染色体上的1000多个基因组位点，实现了百万碱基分辨率的全基因组染色质追踪。图2总结了染色质追踪的这些改进。

染色质追踪的基因组分辨率已从兆碱基 (Mb) 提高到千碱基 (kb)，从而可以在同一细胞中以不同尺度和多尺度方式表征染色质组织。染色质示踪的应用已从人类细胞培养扩展到各种模式生物。染色质追踪还与其他生物分子的成像相结合，以区分组蛋白变异分布、分析 RNA，并研究染色质的层流和核仁关联，从而更全面地了解核组结构及其功能相关性。染色质追踪的基因组通量已经从沿着染色体追踪数十个基因组位点到 1000 个基因座的全基因组追踪得到了改进。缩写：TAD，拓扑关联域。

图2. 染色质追踪的里程碑

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总 结

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基于成像的3D基因组学的一个优势是易于对RNA、蛋白质和其他生物分子以及染色质折叠进行多模式成像。多模态成像的优点是多方面的。首先，它揭示了染色质折叠如何与基因表达相关联。沿着这条线，多项工作将染色质追踪与 RNA  FISH相结合。果蝇胚胎中的一项工作表明，转录爆发仅与多个基因的启动子-增强子接触微弱相关，这表明这些基因的转录不需要持续的启动子-增强子接触。另一项研究观察到与sna基因转录相关的TAD内部组织的变化。在小鼠胎肝中，A-B区室的变化被证明与转录变化有关，并且确定了与基本Scd2基因表达相关的启动子-增强子接触。在人类细胞培养中也观察到与转录爆发相关的 A-B 区室变化。

第二个优势是允许在复杂的组织环境中进行细胞类型特异性分析。为此，使用细胞类型标记基因的单细胞RNA谱来区分小鼠胎肝和果蝇胚胎中的细胞类型，并在两种组织中鉴定了从头细胞类型特异性启动子-增强子相互作用 ，以及小鼠胎肝中不同的细胞类型特异性A-B区室化方案。

第三个优势是将染色质状态和其他核组结构与染色质折叠一起可视化。最初的染色质追踪工作使用组蛋白变体的共免疫荧光标记来区分并分别追踪女性人类细胞中的活性和非活性X染色体。最近的两项研究测量了追踪的基因组位点与其他核成分（包括核仁、纤层和核斑点）的空间关联。正如预期的那样，核仁和椎板关联与B区染色质相关，而核斑点关联与A区染色质相关。此外，在不同的胎肝细胞类型中，核仁和椎板关联水平仅部分由A-B区室解释，密切相关的细胞类型（成红细胞和原红细胞）具有几乎相同的A-B区室化方案，但系统地不同的核仁和椎板关联。图2总结了核结构和细胞成分的多重成像。

预计染色质追踪的基因组分辨率和通量将进一步提高，以实现千碱基分辨率、全基因组染色质追踪，这可以通过增加成像轮数和改进条形码方案以避免同时成像空间相邻位点来实现，以及通过超分辨率或扩展显微镜解析同一图像中的相邻位点。我们还希望将染色质追踪的目的扩展到以概念上类似于染色质追踪中组蛋白变异分布的共同成像的方式来分析表观基因组。最重要的是，我们希望染色质追踪能够应用于各种生物医学环境。特别是，适应新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋的临床样本将为研究人类健康和疾病中的染色质折叠和核组结构提供机会，并可能导致新的诊断、预后和治疗策略。

总之，染色质追踪阐明了3D基因组和核组，并且是剖析基因组序列之外的丰富信息的强大工具。

百迈客提供多种表观检测技术服务，包括染色质可及性测序（ATAC-seq）、染色质构象检测（Hi-C）等，不仅可以辅助结构性变异检测，还能够辅助染色质互作、TAD边界结构等研究，推导出基因组的三维空间结构和基因之间可能的调控关系。

参考文献：

Hu M, Wang S. Chromatin Tracing: Imaging 3D Genome and Nucleome. Trends Cell Biol. 2021 Jan;31(1):5-8. 

原文下载链接：https://international./zh/article/detail/33191055

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