【原】靶向前列腺癌干细胞的转录重编程和新的治疗方法

Transcriptional Reprogramming and Novel Therapeutic Approaches for Targeting Prostate Cancer Stem Cells

Civenni G, Albino D, Shinde D, Vázquez R, Merulla J, Kokanovic A, Mapelli SN, Carbone GM, Catapano CV. Transcriptional Reprogramming and Novel Therapeutic Approaches for Targeting Prostate Cancer Stem Cells. Front Oncol. 2019 May 9;9:385. doi: 10.3389/fonc.2019.00385. PMID: 31143708; PMCID: PMC6521702.

靶向前列腺癌干细胞的转录重编程和新的治疗方法

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，也是西方国家癌症相关死亡的第二大原因。尽管在局部前列腺癌的治疗方面取得了进展，但仍然缺乏针对该疾病的晚期形式的有效疗法。大多数晚期前列腺癌患者对雄激素剥夺疗法 (ADT) 产生抗药性，这仍然是这种情况下的主要治疗选择，并进展为致命的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC)。目前针对前列腺癌的疗法优先靶向增殖、部分分化和依赖 AR 的癌细胞，这些癌细胞构成了肿瘤块的主体。然而，肿瘤起始或肿瘤增殖的干细胞样癌细胞亚群实际上对导致原发或转移部位肿瘤复发的标准治疗具有抗性。了解控制癌症干细胞 (CSC) 亚群的建立、扩张和维持的途径是朝着开发更有效的前列腺癌治疗方法迈出的重要一步，这可能使 CSC 消融或衰竭，并防止治疗抵抗和疾病复发。在这篇综述中，我们重点关注转录调节因子对前列腺 CSC 表型重编程的影响，并提供支持抑制人类前列腺癌 CSC 库维持和扩张的可能性以及当前可用的方法学方法的例子。转录因子是指导特定转录程序和诱导与疾病进展和治疗抗性有关的 CSC 相关表型变化的关键因素。最近的研究表明，在前列腺癌模型中，干扰这些过程会导致 CSC 耗竭，并丧失自我更新和致瘤能力。靶向前列腺 CSC 中的关键转录调节因子是一种有效的治疗策略，有待临床试验的检验。

关键词：前列腺癌，癌症干细胞，转录因子，ERG，ESE3/EHF，c-Myc，STAT3，NF-κB

迄今为止，有令人信服的证据支持在人类癌症中存在肿瘤起始、肿瘤增殖干细胞或癌症干细胞 (CSC) ( 1 , 2 )。在任何给定时间，CSC 可能仅构成肿瘤块内的少数肿瘤细胞 ( 1 , 2 )。然而，CSC 对人类癌症的生物学和临床异质性有很大贡献 ( 3 , 4 )。CSC 模型提出肿瘤细胞维持与正常组织相似的谱系层次结构（2）。维持这种分层组织的少量干细胞样癌细胞既能够通过对称细胞分裂进行自我更新，又能够通过不对称细胞分裂产生具有有限自我更新但具有更大增殖活性的表型不同的子细胞。图 1A）。与正常干细胞相似，自我更新、分化和衰老之间的平衡对于维持 CSC 亚群至关重要 ( 2 )。重要的是，这些过程会导致 CSC 池的扩展和维护，或者逐渐丧失增殖潜力和耗尽。根据干细胞模型，CSC 是驱动肿瘤异质性并促进肿瘤进展和转移的关键因素 ( 2 , 4 )。重要的是，CSC 因其对化学疗法、放射疗法甚至分子靶向药物的内在抗性而在很大程度上导致治疗失败和疾病复发 ( 2 , 3 , 5）。尽管经过有效治疗后体积肿瘤细胞甚至大量减少，但 CSC 亚群可以通过对称和不对称细胞分裂的组合存活、扩增和重建导致肿瘤再生长和复发的体积肿瘤细胞群。图 1B）。事实上，目前的疗法无法影响 CSC 亚群，这导致它们的成功有限以及几乎不可避免的进展为耐药性疾病。在这种情况下，治疗效果、临床反应持续时间和患者生存率的显着提高可能取决于旨在消除或重新编程 CSC 以使其分化和衰老的新治疗策略的临床实施。图 1C）。在这种情况下，了解 CSC 的特殊特性的途径可以为开发 CSC 定向疗法提供理想的目标 ( 4-6 )。

图1

癌症干细胞生物学和癌症治疗的前景。(A)癌症干细胞 (CSC) 是肿瘤细胞的一个亚群，能够通过对称细胞分裂自我更新，并通过不对称分裂产生更多分化的增殖子细胞 (非 CSC)，这些子细胞通过连续的细胞分裂 (对称承诺）构成肿瘤块的大部分。(B) CSC 对化学疗法和其他治疗方式具有内在抗性，并通过在原发或转移部位重建原始肿瘤细胞群而导致疾病复发。(C)靶向 CSC 可能会损害肿瘤再生并降低肿瘤进展和疾病复发的可能性。

在这篇综述中，我们关注前列腺癌和转录调节因子在前列腺 CSC 表型重编程中的作用。我们提供的例子支持通过靶向转录调节因子来干扰人类前列腺癌中 CSC 亚群的维持和扩张的可能性。转录和表观遗传调控因子是指导 CSC 中特定转录程序和表型变化的关键因素 ( 3 , 6）。值得注意的是，最近的工作已经确定，干扰这些过程会导致 CSCs 自我更新能力的丧失和致瘤潜力的耗尽。临床前研究中出现了有前途的化合物。因此，靶向前列腺 CSC 中的转录调节因子可能是在临床前和临床环境中进一步探索的有效治疗策略。

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前列腺癌和当前的治疗前景

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，也是发达国家癌症相关死亡的第二大原因 ( 7 )。尽管局部前列腺癌的治疗取得了进展，但局部晚期和转移性疾病的管理仍然是一项未满足的关键需求 ( 8 , 9 )。最近的基因组研究表明，多种遗传和表观遗传事件有助于前列腺癌的发生和进展 ( 10 – 12 )。转录和表观遗传调节因子的失调表达和活性发生在疾病的早期阶段，并且在从局部到转移性疾病的进展和耐药性前列腺癌的发展过程中特别相关（13, 14 )。此外，复杂的转录和表观遗传重编程有助于癌细胞可塑性或转分化，从而导致获得致瘤性、干细胞样、间充质或神经内分泌特征 ( 15 – 17 )。

前列腺是一种外分泌腺，位于膀胱底部的尿道周围，并产生碱性精液 ( 18 )。组织学上，人类前列腺由假复层上皮组成，该上皮含有基底和腔上皮细胞以及罕见的神经内分泌细胞 ( 19 , 20 )。管腔细胞是分化的分泌性上皮细胞，排列在导管腔内并分泌碱性前列腺液（20）。管腔分泌细胞表达细胞角蛋白 8、细胞角蛋白 18 和雄激素受体 (AR)。基底细胞位于腔细胞之间的基底膜上。基底细胞具有低水平的 AR 并表达细胞角蛋白 5、细胞角蛋白 14 和 p63。基底细胞被认为是正常前列腺上皮中干细胞和祖细胞的主要生态位，尽管最近的谱系追踪研究表明，在小鼠前列腺中，基底细胞和管腔细胞都含有谱系限制的干/祖细胞 ( 19 , 20 )。表达嗜铬粒蛋白 A 和突触素的稀有神经内分泌细胞散布在前列腺中。神经内分泌细胞是 AR 阴性且不依赖雄激素 ( 19 )。

大多数前列腺肿瘤是起源于前列腺周围区域的腺癌 ( 18 )。大多数人前列腺腺癌具有主要的腔表型，少数原发性肿瘤表现出神经内分泌癌、小细胞癌或肉瘤样癌的特征。约 15% 被诊断患有前列腺癌的患者最终会发展为转移性病变，其中约 90% 的病例出现成骨细胞骨转移 ( 18）。在大约 85% 的转移患者中，骨骼是唯一的转移部位。值得注意的是，具有神经内分泌特征 (NEPC) 的侵袭性前列腺腺癌优先形成破骨性骨转移，并且比腺癌型肿瘤更频繁地转移至脑、肝、膀胱和肾上腺 ( 16 )。

前列腺癌的临床演变高度异质，从惰性到非常侵袭性的肿瘤，迅速发展为转移性和难治性前列腺癌 ( 9 , 18 )。手术和放疗对于治疗低风险的局限性前列腺肿瘤非常有效 ( 21 )。由于大多数前列腺癌在诊断时是雄激素依赖性的，因此患有局部晚期或转移性疾病的患者接受雄激素剥夺疗法 (ADT) 治疗，从而限制疾病进展。图 2) ( 8 )。然而，大多数肿瘤最终对 ADT 产生抗药性并发展为致命的转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC)，其治疗选择有限 ( 22 , 23 )。尽管 ADT 的功效降低，但许多 mCRPC 通过多种机制继续具有活跃的 AR 信号转导，包括 AR 基因扩增、剪接变体、点突变、转录上调、配体非依赖性激活，以及雄激素和二氢睾酮 (DHT) 合成增加。肾上腺或肿瘤 ( 9 , 24）。对 AR 信号的持续依赖使得一部分 mCRPC 仍然可能对新的 AR 通路抑制剂 (ARPI) 有反应，例如抗雄激素受体拮抗剂恩杂鲁胺和雄激素生物合成抑制剂阿比特龙。图 2) ( 8 )。然而，mCRPC 可以激活额外的逃逸机制并对 AR 靶向药物产生耐药性 ( 9 )。

图 2

前列腺癌进展和癌症干细胞。前列腺癌以称为前列腺上皮内瘤变 (PIN)的原位癌开始，然后演变为浸润性癌，随后在雄激素剥夺治疗 (ADT) 后发展为转移性去势抵抗性前列腺癌 (mCRPC)。在连续 ADT 或用新的 AR 通路抑制剂 (ARPI) 治疗后，出现了耐药性肿瘤，它们要么保留具有增强的 AR 信号 (Adeno-CRPC) 的腺癌特征，要么获得具有减弱的 AR 信号 (NE-CRPC) 的神经内分泌特征。通过这些阶段的进展和去势抵抗的发展可能是由前列腺癌干细胞的扩增和特定行为驱动的。

摆脱 ADT 的一种新兴方式是表型可塑性，具有获得神经内分泌特征和特征性标志物（如突触素和嗜铬粒蛋白）的表达 ( 15 , 25 , 26 )。该过程涉及与转录激活因子（例如，STAT3、MYC 家族成员、SOX2）和表观遗传效应子（例如，EZH2）相关的多个信号通路的复杂相互作用 ( 16 )。在这种情况下，AR 中性 CSCs 的扩增随后向 NE 表型分化导致低分化肿瘤细胞的后代对雄激素消融或抑制不敏感。图 2）。因此，慢性 ADT 可诱导 mCRPC 去分化或转分化，其中 NEPC 变体在转移性去势抵抗性疾病患者中显着增加。神经内分泌分化可能代表前列腺腺癌向雄激素非依赖状态演变的极端形式。

对 ADT 和 AR 靶向治疗无反应的 mCRPC 用化学疗法治疗 ( 27 )。多西紫杉醇现在是这些患者的标准疗法，尽管在这种情况下的有益效果很少持久（28）。许多患者没有反应，或者在最初的反应之后，对治疗变得难治。多西他赛难治性肿瘤患者通常接受卡巴他赛、第二代紫杉烷或铂 (Pt) 基化合物，例如顺铂和卡铂 ( 21 , 29 )。卡铂、多西他赛或卡巴他赛化疗目前是表现为低 PSA/肿瘤负荷比和快速转移进展或小细胞癌或 NEPC 特征的患者的首选治疗方法（28）。不可避免地，耐药性的快速发展严重限制了这些患者任何形式治疗的反应持续时间和疗效。

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前列腺癌中的癌症干细胞

前列腺癌的细胞组成高度异质 ( 19 )。具有肿瘤增殖和转移产生特性的干细胞样肿瘤细胞的存在可以极大地影响生物异质性、临床进展和治疗反应 ( 19 )。原发肿瘤内的 CSC 可能是前列腺癌患者转移扩散和疾病复发的主要原因。图 2）。此外，独立于 AR 信号传导的 CSC 的扩增可促进去势抵抗的发展以及降低对化疗和放疗的敏感性 ( 19 , 20 , 30 , 31 )。此外，源自基底或腔型祖细胞/干细胞的 CSC 可能表现出不同的特征，并且对前列腺肿瘤的生物学和临床异质性及其攻击行为和治疗抗性的倾向有不同的贡献 ( 19 , 20 , 31 )。

CSC 表现出三个主要特征：启动肿瘤（肿瘤发生）的能力，在至少一个子细胞中维持其细胞特性（自我更新）和复制原始肿瘤的细胞组成（分化程序）（32）。几项研究为前列腺肿瘤中存在自我更新的肿瘤起始干细胞样癌细胞提供了证据 ( 19 )。推定的 CSC 可以使用适当的细胞表面标记物进行纯化，以确定特定的细胞群，并且可以使用体外肿瘤球和体内移植试验评估其特性 ( 33 – 36）。广泛且异质的细胞外标记物组已被用于识别和分离前列腺 CSC ( 37 , 38 )。然而，在不同环境和实验模型中的可重复性和可靠性以及大多数标志物的临床相关性尚未得到任何确定的证明 ( 38 )。细胞内标志物（例如，ALDH）、干细胞重编程因子、转录和表观遗传调节因子（例如，Oct3/4、Sox2、Klf4、Nanog、Myc、BMI1）的表达增加是前列腺 CSC 的特征，并为它们的鉴定提供了额外的工具 ( 36 , 37、39-41 ) 。_ _ _

在实验环境中，体外、离体和体内功能测定与分离 CSC 并评估其含量和特性高度相关 ( 33 – 36 , 42 )。在存在补充血清的细胞培养基的情况下，在贴壁单层中培养前列腺癌细胞，可以增殖异质的大量肿瘤细胞群。图 3A）。在无血清液体或半固体培养基和非粘附条件下的前列腺球或肿瘤球培养物有利于单细胞衍生集落（球状体）的扩增，这些集落富含能够存活和增殖的干细胞样肿瘤细胞在此设置中（34 – 36 , 42）。源自人类或小鼠肿瘤的类器官培养物是一种替代方法，可保留原始肿瘤细胞组成的异质性，并在包含微环境的三维系统中测试药物功效 ( 43 , 44）。然而，与肿瘤球培养系统不同，类器官不会专门为 CSC 富集，也不允许直接评估具有干细胞样特性的肿瘤细胞。通过皮下或原位植入免疫缺陷小鼠的已建立的人类癌细胞系或患者来源的肿瘤细胞的异种移植物可以成为干细胞样肿瘤起始细胞的可靠和可重复来源，并用于评估体内致瘤性和自我更新特性通过连续再植入小鼠分离的 CSCs (图 3B）。小鼠的长期肿瘤再生以及体外可重复的肿瘤球形成能力是分离的肿瘤细胞具有干细胞样能力的重要证据 ( 35 , 36 , 45 )。此外，一个新兴的研究领域涉及来自前列腺癌基因工程小鼠 (GEM) 模型的 CSC 的分离、表征和繁殖。图 3C）。这些 GEM 模型再现了模拟人类癌症的前列腺肿瘤，在原位前列腺微环境中和存在完整免疫系统的情况下具有类似的明确遗传改变，因此正在成为研究前列腺 CSC 行为和对治疗的反应的宝贵资源 ( 19 , 46 , 47 ) ）。

图 3

可用于研究癌症干细胞的体外和体内实验模型。(A) 体外系统包括贴壁大块肿瘤细胞的标准培养物和能够自我更新的富含癌症干细胞 (CSC) 亚群的肿瘤球培养物。(B)小鼠异种移植模型允许在离体肿瘤球测定和体内连续再植入测定中分离 CSC 并监测自我更新和致瘤性。(C)通过分离和传播富含 CSC 的肿瘤球体，可以使用基因工程小鼠 (GEM) 模型进行肿瘤球测定和体内连续再植入。

如果应用得当，这些实验系统共同代表了监测遗传和药理学干预对 CSC 影响的可靠工具。此外，需要在临床前和临床研究中严格实施这些体外/体内测定以及补充方法（例如基因特征、表面标志物），以证明 CSC 指导策略的有效性并监测肿瘤细胞亚群的动态变化治疗后 ( 5 , 48 )。这些研究将为确定以精准医学方法改善癌症治疗的最佳策略提供大量基本信息。

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前列腺癌干细胞中的典型信号通路

目前针对前列腺癌的疗法优先靶向部分分化的、依赖于 AR 的增殖性肿瘤细胞，这些细胞构成局部晚期和转移性肿瘤中的大部分肿瘤块 ( 8 , 21 , 28 , 29 )。然而，CSC 亚群实际上对这些疗法不敏感，并且可以在原发和转移部位重新填充肿瘤 ( 19 , 49）。了解控制 CSC 库的建立、扩展和维持的途径将是朝着开发更有效的前列腺癌治疗方法迈出的重要一步，能够消融或耗尽 CSC 并防止治疗抵抗和疾病复发。已将许多重点放在被确定为正常干细胞中干细胞特征驱动因素并被证明在 CSC 中具有相似功能的典型途径上。

典型的干细胞相关通路，如 Sonic-Hedgehog、Wnt 和 Notch，在 CSC 维持中发挥重要作用，并代表了探索根除前列腺 CSC 的有希望的目标 ( 50 , 51 )。在典型的 Wnt 通路中，Wnt 配体与卷曲受体和辅助受体 LRP 5/6 结合，导致 β-连环蛋白的稳定和核转位，β-连环蛋白作为促肿瘤基因表达的转录激活剂 ( 50 )。β-catenin 的表达和定位改变在晚期前列腺癌中很常见，Wnt 信号通路可以直接促进前列腺 CSCs 的自我更新（52 – 55）。Hedgehog 通路在胚胎发生和成年期控制正常干细胞的细胞更新和存活 ( 50 )。Hedgehog 信号通过一组特定的配体（Desert、Indian 和 Sonic）与 Patched（Ptch1 和 2）和 Smoothened (SMO) 的膜受体结合来激活。在配体存在的情况下，SMO 解除 PTCH 的抑制并促进转录因子 Gli 的核转位，从而触发特定靶基因的表达。与其他癌症一样，前列腺肿瘤经常表现出异常激活的 Hedgehog 信号传导 ( 56 , 57 )，这会促进前列腺 CSC 的扩张 ( 58 , 59 )）。一组复杂的受体（Notch1-4）和配体（DLL 1、DLL 3、DLL 4、Jagged 1 和 Jagged 2）控制着 Notch 信号传导 ( 50 )。配体结合后，受体的细胞质结构域被蛋白水解酶（ADAM 和 γ-分泌酶）切割，导致 Notch 胞内结构域 (NICD) 的释放，其在细胞核中移动并激活靶基因的转录。Notch 信号通路在人类癌症（包括前列腺肿瘤）中被不当激活，它会改变正常的分化程序并导致 CSC 扩张 ( 50 , 60 – 62 )。在前列腺癌中，Notch 和 Hedgehog 信号的联合上调促进了干细胞样表型和治疗耐药性 ( 63 ,64 )。

Hedgehog、Wnt 和 Notch 通路的抑制剂已经开发出来，其中一些已经在肿瘤患者的临床试验中进行了测试 ( 50 )。用选择性抑制剂靶向这些干性相关通路具有有效的抗 CSC 作用，并在临床前模型中积极影响对其他癌症治疗的反应 ( 65 , 66 )。Notch 通路抑制剂已显示出增强前列腺癌临床前模型中化疗和 ADT 活性的功效 ( 67 – 71 )。Hedgehog 抑制剂在前列腺癌中具有抗 CSC 作用，可降低小鼠干性相关基因的表达和肿瘤异种移植物的生长 ( 63 , 72 – 74）。Wnt 通路抑制剂也已在前列腺癌的临床前模型中成功测试，尽管没有系统地提供直接抗 CSC 作用的证据 ( 54 , 65 , 66 , 75 )。Wnt 抑制剂包括在各种实验性癌症模型中显示出相关活性的有前景的化合物 ( 53 , 76 – 78 )。

包括前列腺癌在内的多种癌症类型正在进行的试验正在测试经典干性通路抑制剂的功效 ( 48 , 79 , 80 )。值得注意的是，第一个获批用于临床的抑制剂vismodegib（GDC-0449）和其他Hedgehog抑制剂正在针对前列腺癌患者进行临床试验。同样，一些 Wnt 和 Notch 通路抑制剂目前正在接受临床评估，用于治疗各种类型的肿瘤患者，包括前列腺癌患者 ( 80 – 82）。这些早期临床研究旨在确定这些化合物的功效和毒性，它们将为作为单一药物或组合方案的进一步开发提供有见地的信息 ( 48 )。然而，未来利用临床前研究中开发的一些分析方法具体评估这些化合物是否影响前列腺 CSC 亚群是很重要的。由于有限的治疗窗，排除这些药理途径抑制剂对正常干细胞的影响和预防毒性可能也很困难 ( 5 , 48 )。

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前列腺 CSC 中的转录调节剂

前列腺 CSC 呈现出各种转录和表观遗传调节因子（例如 Nanog、SOX2、BMI1 和 EZH2）的过度表达，这些调节因子直接参与重编程 CSC 转录组和维持干细胞样表型。其中一些因素已被有效地靶向诱导 CSC 耗竭和抵消治疗抗性 ( 41 , 83 – 87 )。EZH2 和 BMI1 的小分子抑制剂是两种表观遗传效应物，它们已在前列腺癌临床前模型中显示有效 ( 25 , 26 , 85 , 88 – 92 )。此外，EZH2抑制剂正在晚期肿瘤患者中进行临床试验。

其他转录调节因子正在成为前列腺 CSC 中的可靶向元件，为抗 CSC 治疗干预开辟了新的机会。在以下部分中，我们描述了最近的数据，并提供了这些方法针对前列腺 CSC 的有效性的原理示例证明。

c-Myc

控制 CSC 增强的自我更新能力和降低的分化潜能的其他途径可以为开发 CSC 特异性治疗策略提供理想的目标。在晚期和 mCRPC 中异常激活的几种转录因子可直接导致前列腺 CSC 的扩增和致瘤潜能。c-Myc (Myc) 是一种转录因子，涉及许多生物过程，包括转录、复制、细胞分裂、蛋白质合成和代谢 ( 93 )。Myc 的扩增、染色体易位和失调的表达是人类癌症中最常见的改变之一（93）。Myc 在原发性和转移性前列腺癌中经常上调，其过度表达与进展为 CRPC 相关 ( 94 )。许多证据表明，Myc 在确保人类癌症中 CSC 的肿瘤发展和维持方面具有重要作用 ( 31 , 95 – 97 )。Myc 与其他干细胞基因如 SOX2、BMI1 和 OCT-4 一起，在具有 CD44+/CD24- 表型的前列腺癌细胞中高度表达，这被认为是干细胞/祖细胞的标志 ( 36 , 98 )。然而，与许多其他转录因子类似，Myc 是一个难以用常规小分子药物直接解决的目标（99）。已经尝试了多种方法来靶向 Myc，通过使用小分子、肽、寡核苷酸和小干扰 RNA 阻断 Myc 蛋白相互作用、MycDNA 相互作用和 Myc 转录或翻译 ( 99 – 102 )。很少有抑制 Myc 的化合物进入临床研究的早期阶段 ( 100 )。

继之前通过基于寡核苷酸的方法（ 103、104）对 Myc 转录和启动子调控进行的研究之后，我们最近表明，使用基于启动子靶向 siRNA 的新策略可以在表观遗传上沉默 Myc 转录（105 ）。这种方法依赖于与基因转录起始位点重叠并正向调节 Myc 基因转录的顺式作用非编码启动子相关 RNA (paRNA) 的存在 ( 105 )。针对这种 paRNA 的 siRNA 通过干扰基因启动子处转录前起始复合物的形成来抑制 Myc 转录（105）。这种策略导致长期抑制 Myc 转录。有趣的是，在 DU145 和 PC3 细胞系等 CRPC 模型中，用靶向启动子的 siRNA 对前列腺癌细胞的单次转染诱导了对细胞增殖和集落形成的长期影响，这表明由于 Myc 沉默导致增殖潜力持续丧失（105）。值得注意的是，使用这种启动子靶向策略，我们能够证明 Myc 沉默损害了前列腺 CSC 亚群的维持和诱导衰老，从而阻断了它们的扩张和致瘤潜力（36）。我们表明，源自这些人类癌细胞系并在干细胞选择性条件下生长的肿瘤球形成细胞保留了高自我更新能力，并具有高致瘤潜力和重建原始肿瘤细胞群的能力。Myc 沉默损害了体外肿瘤球体的传播、皮下肿瘤的生长和小鼠体内转移的形成 ( 36 )。与对 CSC 的影响一致，由 Myc 耗尽的细胞形成的肿瘤减少了能够在小鼠体内形成离体肿瘤球并产生继发性肿瘤异种移植物的干细胞样肿瘤细胞的含量。因此，这些离体分析直接证实了 Myc 沉默的抗 CSC 作用。值得注意的是，降低的 CSC 含量和致瘤能力与体外和体内CSC 的衰老增加有关。因此，Myc 沉默导致 CSC 耗竭并通过激活 CSC 中的潜在衰老程序降低其致瘤和转移潜能（36）。因此，这项研究提供了 Myc 在维持人类肿瘤中 CSC 中的作用的直接证据，并确定了自我更新的丧失和诱导衰老是肿瘤起始和转移性前列腺 CSC 耗竭的主要机制。这些数据还表明，基于 RNAi 的调节性非编码 RNA 靶向可能是调节基因表达以用于治疗应用的有效策略。

针对 Myc 的上游调节器或下游效应器也是一种有效的方法（100、102）。值得注意的是，溴结构域和末端外结构域 (BET) 蛋白，例如 BRD4，与乙酰化组蛋白结合并与包括 Myc 在内的多种致癌转录因子协同作用 ( 106 )。重要的是，旨在破坏 BET 蛋白-染色质相互作用的化学抑制剂会干扰 Myc 和其他转录因子的表达和活性 ( 107 – 110 )。BET 抑制剂是多种癌症临床前模型中的有效抗癌剂（111）。目前，几种 BET 蛋白抑制剂（如 ZEN003694、OTX015/MK-8628、ABBV-075、INCB057643、GSK525762/I-BET762、GS-5829）正处于 I/II 期临床试验中，一些研究专门评估其在前列腺癌患者单独使用或与 AR 靶向治疗联合使用 ( 112 )。在前列腺癌中，BET 蛋白抑制剂调节 AR 信号并增强 AR 靶向治疗对 AR 阳性前列腺癌细胞（如 VCaP 和 LNCaP 细胞）的抗雄激素作用，使其成为治疗 mCRPC 的合适药物 ( 113 – 116 )。有趣的是，BET 蛋白抑制剂会干扰临床前癌症模型中的Myc功能（106、108、110)，因此，在前列腺 CSC 中也有可能抑制 Myc 依赖性过程。

状态3

信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 是多种信号通路中的关键元件，在许多人类癌症中异常激活 ( 117 – 120 )。酪氨酸 705 (Tyr705) 的磷酸化由蛋白酪氨酸激酶如 Janus 激酶 (JAK) 催化，通过诱导 STAT3 单体的二聚化、核积累和 DNA 结合来调节 STAT3 转录活性 ( 117 , 118 )。IL-6/JAK 通路是 Tyr705 磷酸化的主要负责人，该通路的激活有助于许多实验模型中的肿瘤发展 ( 117 , 118 )。STAT3 激活与晚期疾病、转移和临床进展相关（118 )。尽管最近有一些有争议的观察结果，但这种转录因子在临床和实验系统中的肿瘤发生中的作用及其作为治疗靶点的潜力的证据相当压倒性[有关这些问题的广泛讨论，请参见 ( 119 – 121 )]。

越来越多的证据表明 STAT3 也定位于线粒体并且在控制线粒体功能方面很重要 ( 120 , 122 , 123 )。线粒体 STAT3 在丝氨酸 727 (Ser727) 处被各种丝氨酸蛋白激酶磷酸化，而核 STAT3 主要在 Tyr705 处被酪氨酸蛋白激酶磷酸化，如 JAK 家族激酶 ( 124 , 125 )。有趣的是，组成型 Ser727 磷酸化的 STAT3 存在于许多人类癌症中，并且足以在各种模型中驱动肿瘤发生，而不依赖于 Tyr705 磷酸化 ( 124 , 126 , 127）。此外，线粒体 STAT3 对肿瘤细胞在微环境或治疗诱导的应激条件下的存活至关重要，这反映了肿瘤对 STAT3 线粒体功能的特异性依赖性 ( 124 , 128 )。

大量证据揭示了 STAT3 在前列腺癌中的关键作用。STAT3 在人类癌症（包括前列腺癌）中的过度活性通常是上游通路失调的结果，其激活与细胞因子和生长因子受体相关的蛋白酪氨酸激酶，如 JAK 家族激酶 ( 123 )。在患有转移性肿瘤和 CRPC 的患者中检测到 IL-6、IL-6 受体、JAK1 和 pSTAT3 水平升高 ( 129 , 130 )，并且与预后不良有关 ( 131 , 132 )。IL-6/JAK/STAT3 通路有助于在靶向抗癌药物或 ADT 后促进肿瘤细胞存活的治疗耐药性 ( 133 , 134）。该通路是肿瘤-微环境串扰的中心，促进了治疗耐药性和干性 ( 134 , 135 )。STAT3 的激活还可以通过在肿瘤微环境中分泌免疫抑制细胞因子来促进前列腺癌的免疫耐受性和化疗耐药性 ( 136 )。相反，抑制 IL-6/JAK/STAT3 途径可减少肿瘤细胞增殖并恢复对 AR 靶向药物的敏感性 ( 137 – 139 )。重要的是，近年来，针对 IL-6/JAK/STAT3 通路的抗体（例如，siltuximab）已在各种临床试验中作为单一疗法或与细胞毒性药物联合用于治疗癌症（包括前列腺癌）进行测试。119、140 – 142 )。_ 然而，尽管临床前模型中的数据呈阳性，但晚期前列腺癌患者的临床活性并不显着或不显着（119、140 – 142 ） ，这表明抗 IL-6 疗法可能不是阻断 STAT3 信号传导的最有效方法在这个设置中。

STAT3 水平升高以及 Tyr705 和 Ser727 磷酸化在人类前列腺癌的早期（雄激素依赖性）和晚期（去势抵抗）阶段都很常见 ( 143 )。STAT3 激活与前列腺癌患者的不良临床结果相关 ( 144 , 145 )。重要的是，STAT3 的激活与前列腺癌中 CSC、致瘤性和转移能力的促进和维持有关 ( 133 , 146 , 147 )。STAT3 的替代激活途径和非转录功能在 CSC 维持中也可能很重要（122）。在前列腺癌中，Ser727 磷酸化的诱导可在 Tyr705 磷酸化不存在的情况下促进细胞转化和肿瘤发展 ( 126 )。在这个实验系统中，STAT3 的致癌作用严格依赖于 Ser727 的磷酸化以及 STAT3 的转录依赖性和独立功能（126）。有趣的是，我们发现在以 ETS 因子 ESE3/EHF 表达减少为特征的前列腺癌亚群中，STAT3 上调和激活依赖于 microRNA miR-424 的过表达，它阻止了 STAT3 的蛋白酶体降解并导致增加总 STAT3 蛋白水平（148）。值得注意的是，miR-424 上调与细胞系和人类肿瘤中 CSC 特征的获得相关，证实了这种非经典 STAT3 激活途径与前列腺 CSC 干性和致瘤性的相关性 ( 148 )。

使用化学抑制剂或可溶性 IL-6R 干扰 IL-6/JAK 信号传导的抗 CSC 作用支持 CSC 区室中 STAT3 激活的相关性（133、146、149 – 152）。Napabucasin (BBI608) 是一种被提议用于干扰 STAT3 信号传导的小分子抑制剂，已在临时设计的临床前模型中显示可抑制干细胞样肿瘤细胞 ( 153 )。该化合物已在临床前环境中作为单药和药物组合进行了广泛研究，以利用同时靶向 CSC 和非 CSC 肿瘤细胞群的优势，目前在几项临床试验中与晚期癌症的标准疗法联合进行测试。152、154 ) 。_ 除了 STAT3 通路或间接抑制剂外，还开发了各种直接 STAT3 抑制剂，其中一些已在前列腺癌模型中进行了测试 ( 119 )。我们最近发现 STAT3 OPB-31121 和 OPB-51602 的小分子抑制剂直接与 SH2 结构域结合并通过多个 STAT3 依赖性途径有效阻断全局下游信号传导，在前列腺癌细胞模型中非常活跃，并且在CSC隔室（128、155）。OPB-31121、OPB-51602 和第三种结构相关的化合物 OPB-111077 已进入 I/II 期临床试验，显示作为单一药物对晚期实体瘤患者的一些有限疗效（156– 159 )。这些抑制剂阻断 Tyr705 和 Ser727 磷酸化并损害核和线粒体 STAT3 的功能 ( 128 )。重要的是，在 DU145 肿瘤异种移植物（一种 CRPC 模型）中，OPB-51602 显着抑制了肿瘤生长并在停止治疗后阻止了肿瘤细胞的重新增殖 ( 128 )。这些效应与 OPB-51602 处理后肿瘤异种移植物中干细胞样肿瘤细胞部分的显着消耗相关，如通过离体流式细胞术和肿瘤球测定法评估的 ( 128 )。

在人类癌症中，STAT3 激活通常伴随着 NF-κB 转录因子途径的激活 ( 160 )。NF-κB 在晚期前列腺癌中经常被激活，并与 CSC 的扩张有关 ( 37 )。值得注意的是，STAT3 和 NF-κB 诱导了一组高度重叠的促肿瘤基因，这些基因可能在前列腺 CSC 中具有重要功能 ( 160 )。NF-κB 的激活和与 IL6/JAK/STAT3 信号通路的串扰对于在侵袭性前列腺肿瘤中获得上皮间质转化 (EMT) 和 CSC 特征至关重要 ( 161）。此外，取决于细胞环境和微环境刺激，多个正反馈回路和负反馈回路将导致相互激活或抑制的两条途径联系起来（160）。有趣的是，我们发现前列腺 CSC 中 STAT3 和 NF-κB 的活性显着高于大块肿瘤细胞，并利用了通过生物合成基因工程产生的新型嵌合多激酶抑制剂 EC-70124 的可用性。天然化合物的途径 ( 151 )。这种新化合物对 IKKβ 和 JAK 激酶特别有效，它们分别催化激活 NF-κB 和 STAT3 的关键步骤（162）。因此，我们推断 EC-70124 同时靶向 NF-κB 和 STAT3 的能力可以提供一种创新策略来破坏两种转录因子之间的促肿瘤发生串扰，并避免个别途径靶向和激活替代生存途径的不利影响. EC-70124 有效阻断前列腺癌细胞中的 NF-κB 和 STAT3 活性，特别是在肿瘤球细胞中，这些途径的组成性激活 ( 151 )。此外，该药物减少了体外肿瘤球的形成和体内肿瘤的生长（151）。值得注意的是，EC-70124 对肿瘤异种移植物中的 CSC 亚群具有深远的影响。通过离体进行研究后一方面在体内治疗结束时对从肿瘤异种移植物中直接分离的细胞进行测定，并确定保留 CSC 特征和自我更新能力的肿瘤细胞比例 ( 151 )。因此，EC-70124 对 STAT3 和 NF-κB 的双重抑制会损害小鼠的 CSC 维持和肿瘤发展，并为治疗前列腺癌的新治疗策略提供基础。

尔格

ETS 转录因子构成了一大类转录调节因子，在细胞分化和癌变中具有重要作用 ( 163 )。ETS 家族包括 27 个成员，它们共享高度保守的 ETS 结构域（163）。单个 ETS 因子具有不同的细胞和组织特异性表达模式，并诱导不同的转录和生物学反应。个体 ETS 因子之间的这种多样性反映在肿瘤发生中的不同作用 ( 163 )。ETS 因子在许多人类癌症中失调，可以促进或抑制肿瘤发生 ( 163 )。

相当比例的前列腺癌表现出 ETS 基因 ERG 和 TMPRSS2 基因 5' 区域的特定基因融合 ( 164 )。TMPRSS2 基因编码在前列腺上皮细胞中高度表达的丝氨酸蛋白酶。这种遗传事件导致由雄激素调节的 TMPRSS2 启动子在前列腺上皮细胞中驱动的全长（或最小截短）ERG 蛋白的过表达 ( 164 – 166 )。有趣的是，最近的研究表明靶向药物 ERG 治疗前列腺癌的新选择（167 – 169）。ERG 的异位表达导致细胞转录组的复杂变化和致瘤特性的获得。然而，异常表达的 ERG 在前列腺癌进展中的生物学影响及其潜在机制仍不清楚 ( 170 , 171 )。在相关数量的人类前列腺癌中，ERG 基因融合伴随 PTEN 缺失 ( 172 )。这两种事件的共存通常与更具侵袭性的疾病有关（172）。重要的是，ERG 获得和 PTEN 损失的合作在小鼠模型中得到了概括，其中 ERG 转基因小鼠与 PTEN 缺陷小鼠杂交产生明显的恶性病变并进展为侵袭性腺癌（172-174 )。

我们最近使用这些具有前列腺特异性 ERG 表达（Pb-Cre4；Rosa26ERG/ERG）的 GEM 模型，有和没有 PTEN 缺失，以检查 ERG 融合阳性前列腺癌中肿瘤进展的机制。ERG 转基因小鼠无法发展为侵袭性腺癌，而联合 ERG/PTEN（Pb-Cre4；Ptenflox/flox；Rosa26ERG/ER）小鼠发展为大的侵袭性肿瘤（172）。因此，这些 GEM 模型代表了评估与前列腺癌进展相关的事件的良好系统。此外，为了检查肿瘤进展与 CSC 之间的关系，我们利用已建立的方案从体内分离和分析肿瘤增殖干细胞样肿瘤细胞楷模。重要的是，我们发现来自 ERG/PTEN 小鼠的前列腺肿瘤高度富集干细胞样癌细胞，当铺在前列腺球培养条件下时会形成大的肿瘤球体 ( 47 )。肿瘤球体对细胞角蛋白呈阳性，证实了它们的上皮起源并表达了典型的干细胞标志物。此外，ERG/PTEN 衍生的肿瘤球体具有很高的体外自我更新潜力，并且在重新植入小鼠体内时能够高效地产生肿瘤 ( 47 )。

使用该系统，我们最近评估了可能干扰 ERG 诱导的转录和表型重编程的化合物的活性。基于在 ERG 融合阳性肿瘤的 ERG 激活靶标中发现了部分 ERG/Sp1 共调节基因，我们测试了一种新型 DNA 结合和 Sp1 干扰化合物 demycarosyl-3D-β-D-的活性ERG 阳性模型中的洋地黄毒苷-光神霉素 SK (EC-8042) ( 47 )。具体来说，我们发现 EC-8042 是 ERG 融合阳性 VCaP 细胞形成肿瘤球的有效抑制剂，这是药物抗 CSC 活性的量度。有趣的是，这种效应与 ERG/Sp1 靶基因的表达降低以及体内侵袭性和转移性受损有关在鸡绒毛尿囊膜 (CAM) 系统 ( 47 ) 中。CAM 检测提供了一个简化的系统来评估活鸡胚胎中的肿瘤生长、侵袭、迁移、血管循环和转移。为了进一步研究 EC-8042 对肿瘤增殖干细胞样细胞的影响，我们利用了 ERG/PTEN GEM 模型。EC-8042 治疗减少了体外ERG/PTEN 小鼠肿瘤球体的形成，并损害了小鼠肿瘤球体细胞的再植入 ( 47 )。EC-8042 的全身治疗抑制了肿瘤进展，减少了 ERG/PTEN 小鼠前列腺腺癌的侵袭和增殖区域。此外，EC-8042 对 ERG/PTEN 小鼠的 CSC 亚群有显着影响，如减少所示离体肿瘤球形成和 CSC 标志物表达 ( 47 )。这些数据首次确定了拮抗 ERG 致癌活性以阻断 ERG 阳性前列腺肿瘤模型中 CSC 维持和扩张的功效，从而为治疗该疾病开辟了新的可能性。

ESE3/EHF

ESE3/EHF 是上皮特异性亚家族的 ETS 家族转录因子。ESE3/EHF 在正常前列腺上皮细胞中高度表达，对上皮细胞分化至关重要。有趣的是，我们发现 ESE3/EHF 和 ERG 是人类前列腺癌中最常见的失调 ETS 因子之一 ( 175 , 176 )。重要的是，永生化人前列腺上皮细胞中 ESE3/EHF 的下调导致转化、去分化、EMT 和 CSC 特性的获得（35）。此外，我们发现了一组前列腺肿瘤，它们在没有其他 ETS 基因（包括 ERG）改变的情况下表现出 ESE3/EHF 表达显着降低。与 EMT 和 CSC 表型相关的转录特征的富集以及不良临床结果表征了 ESE3/EHF 表达缺失的肿瘤 ( 35 )。在后续研究中，我们在理解 ESE3/EHF 的肿瘤抑制作用方面取得了进一步的进展，特别是在其在细胞分化和干性中的功能方面。通过体外肿瘤球体和体内异种移植物再植入试验研究了 ESE3/EHF 和 CSC 特性之间的联系( 35 , 45）。永生化正常前列腺上皮细胞（如 RWPE1 和 LHS）中的 ESE3/EHF 敲低是前列腺上皮细胞中干细胞样、致瘤和自我更新能力的有效诱导剂 ( 35 )。此外，我们确定 ESE3/EHF 控制关键基因和特异性参与上皮分化和 CSC 维持的 microRNA ( 35 , 45 , 148 )。总的来说，这些发现还提出了多种策略来靶向 ESE3/EHF 表达缺失的肿瘤并逆转其侵袭性表型。

我们发现 ESE3/EHF 下调导致干细胞因子 Lin28A/B 以及其他干性相关因子的表达增加 ( 45 )。Lin28 A/B 是 let-7 家族成熟 microRNA 加工的关键元件，它们是有效的肿瘤抑制因子和抗 CSC 效应子 ( 177 )。因此，我们评估了敲除 Lin28 对具有 ESE3/EHF 下调的转化前列腺上皮细胞的致瘤和干细胞样特性的影响。Lin28 敲低降低了小鼠 CSC 标志物的表达和维持肿瘤形成的能力 ( 45 )。因此，离体肿瘤球分析显示，在 Lin28 耗尽的肿瘤异种移植物中，干细胞样细胞显着且持续减少。此外，在连续再植入实验中，Lin28 敲低显着降低了前列腺 CSC的体内自我更新和致瘤潜能 ( 45 )。因此，靶向 Lin28 可以重新激活前列腺 CSC 中的潜在分化/衰老程序，并导致它们在 ESE3/EHF低前列腺肿瘤中的消融 ( 45 )。基于这些发现，我们最近评估了 Lin28A/B 的第一种化学抑制剂 ID1632，并在体外证明了它在 CSC 培养系统中的显着活性（178)，建议替代基于 siRNA 和短寡核苷酸的方法 ( 45 , 179 )。所有这些针对 Lin28A/B 和抵消 ESE3/EHF 沉默影响的方式都处于早期临床前研究阶段。

我们观察到 ESE3/EHF 对 STAT3 的激活状态也有相关影响。通过在一组原发性前列腺肿瘤和正常前列腺中进行 miRNA 表达谱分析，我们有匹配的基因表达数据，我们发现与正常前列腺相比，许多 microRNA 在肿瘤中显着失调。我们将 miR-424 鉴定为 ESE3低肿瘤和细胞系中最上调的 miRNA 之一( 148 )。功能测定表明，ESE3/EHF 抑制了正常前列腺上皮细胞中 miR-424 的转录，而 ESE3/EHF 的缺失引发了癌细胞中 miR-424 的上调（148）。在 miR-424 的潜在靶标中，我们发现 E3 泛素连接酶 COP1 在 ESE3/EHF 表达不足的前列腺肿瘤细胞中 miR-424 诱导的表型中起关键作用。有趣的是，后续研究表明，miR-424 介导的 COP1 沉默导致 STAT3 蛋白酶体降解受损，从而导致该致癌转录因子的稳定和组成型激活 ( 148 )。重要的是，miR-424 上调促进了 EMT 和肿瘤球形成，这些特征与 CSC 表型相关。此外，一种合成的 miR-424 拮抗剂可减少体外肿瘤球的形成并损害小鼠产生肿瘤的能力（148）。几种基于 miRNA 的疗法目前正在临床试验中，它们代表了用于靶向致癌和肿瘤抑制途径的有前景的工具 ( 180 )。

ESE3/EHF 还通过控制 IL-6 转录来调节 STAT3 活性 ( 150 )。我们观察到 ESE3/EHF 和 IL-6 的表达在原发性和转移性前列腺癌中显着反相关。ESE3/EHF 与 IL-6 启动子结合并抑制 IL-6 转录 ( 150 )。此外，在来自 ESE3/EHF 表达不足的肿瘤细胞的肿瘤球中，IL-6、磷酸化的 STAT3 和 STAT3 转录活性持续上调，这与前列腺 CSC 中 IL-6/JAK/STAT3 通路的异常激活一致。为了测试拮抗 IL-6/JAK/STAT3 通路在 ESE3/EHF 低表达肿瘤中的作用，我们使用了 JAK2 抑制剂 NVP-BSK805（150）。NVP-BSK805 显着减少 ESE3/EHF 低表达模型中的肿瘤球形成。此外，用 NVP-BSK805 治疗抑制了肿瘤异种移植物的生长和源自 ESE3/EHF 敲低模型的肿瘤球细胞的自我更新能力，表明 CSC 隔室通过破坏 IL-6/JAK/STAT3 轴持续受到损害。 ESE3/EHF低肿瘤的背景 ( 150 )。许多 JAK 抑制剂目前正处于肿瘤和非肿瘤适应症的临床试验中（181)，使它们用于抵消前列腺癌特定亚型中的 CSC 扩张成为一个可合理检验的假设。总的来说，这些数据表明 ESE3/EHF 活性对于维持前列腺上皮细胞分化和自我更新之间的平衡是必不可少的，并且这种转录调节因子的表达丧失是侵袭性肿瘤的特征，特别容易受到旨在恢复肿瘤抑制功能的方法的影响。 ESE3/极高频。

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结论

近年来，越来越多的证据表明 CSC 在前列腺癌的发生和发展中的作用。前列腺 CSC 在晚期患者治疗失败和疾病复发的去势抵抗性和表型可塑性中起关键作用。针对前列腺 CSC 的疗法可以为这些患者带来有效的治疗。抗 CSC 策略应补充目前旨在减少 AR 依赖和增殖的大块肿瘤细胞的治疗方法。剖析控制表征 CSC 亚群的动态表型变化的分子机制是设计旨在根除 CSC 的精确治疗干预措施的强制性先决条件。干细胞重编程因子、转录调节因子、和表观遗传效应子维持前列腺 CSC 的维持和扩张，并可能代表有效的治疗靶点。我们已经表明，阻断源自人类细胞系、异种移植物和 GEM 模型的前列腺 CSC 中异常上调的转录因子的表达和功能会导致 CSC 亚群的大量消耗和自我更新和致瘤能力的严重损害。这些基于使用小分子化学抑制剂或合成 siRNA 的方法提供了创新策略来破坏维持前列腺 CSC 表型的促肿瘤发生信号。然而，尽管过去几十年取得了巨大进步，1、3、5、48 ) 。_ _ _ _ _ 单细胞基因组学和空间转录组学 ( 182 – 186 ) 等新兴技术的应用将有助于解决在小鼠模型和人体样本纵向研究中前列腺 CSC 的干细胞生态位组成、解剖位置、生物学和基因组异质性等重要问题. 基因组和蛋白质组学方法可能会导致特定 CSC 特征的发展，以应用于临床前模型和人体样本，并探测 CSC 群体，并在疾病过程中和对治疗的反应中表征它们的异质性和进化 ( 31 , 95 , 187 )）。对于大多数患者来说，针对大块肿瘤细胞的标准疗法与更具选择性的抗 CSC 疗法的组合可能是最可靠的治疗方法。可能还需要联合靶向多种 CSC 途径，以实现对高度异质性肿瘤中 CSC 亚群的有效控制并避免 CSC 逃逸。设计合理的临床前研究和临床试验应调查与肿瘤基因型和表观遗传特征相匹配的多种策略的可行性和有效性。

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