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Jackson公司直接和间接蛋白质印迹前言： 蛋白质印迹是一种强大的技术，它使用抗体来检测通过电泳分离后固定在印迹膜上的蛋白质。该技术可以直接或间接执行。每种方法都可以根据实验要求提供优势。 一旦通过凝胶电泳分离蛋白质并转移到印迹膜上，就可以通过一个或两个步骤进行蛋白质印迹。 在直接检测方法中（图 1 (A)），在单个孵育步骤后，直接与报告酶或荧光染料偶联的一抗用于检测印迹膜上的蛋白质抗原。虽然这种一步法速度更快，但并未广泛使用。图1（B）说明了直接偶联一抗的问题之一，报告分子可以封闭一抗的抗原结合区，阻碍对抗原的良好识别，导致灵敏度降低。 过量的初级可以补偿这种影响，但可能导致重现性差和背景增加。 Jackson公司：间接——两步法 Western blotting的两步间接检测方法避免了对抗原检测的干扰。未标记的一抗与结合在印迹膜上的抗原形成复合物。洗涤后，印迹与偶联有报道酶或荧光团的二抗一起孵育。多个二抗与一抗上的表位结合，形成标记的抗原-抗体复合物（图 1(C)）。尽管间接方法需要一个额外的洗涤和孵育步骤，但与直接方法相比，它具有许多优势，包括信号放大和灵活性。 下表详述了直接和间接检测方法的优缺点。它们适用于蛋白质印迹，但也可能与其他技术相关，例如 IHC/ICC、ELISA 和流式细胞术。
备注： 图 1：(A) 直接偶联的一抗与结合在膜上的抗原结合。(B) 直接偶联的一抗与与膜结合的抗原结合较差，因为报告酶或荧光团可以偶联到抗原结合区域并降低抗体对其靶标的亲和力。使用辅助消除了这一点。(C) 间接方法 - 多个偶联二抗与未偶联一抗结合。 表 1：直接和间接西方印迹方法的优缺点。 参考文献： Alberts B et al (1994) Molecular biology of the Cell. 3rd Ed. Garland press. London Roitt et al (2005) Immunology. 6th Ed. Mosby. Spain |
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