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——背景—— 萜类化合物是一类由异戊二烯单元合成的天然产物的总称，具有丰富的化学结构与生物学功能。许多萜类化合物是高价值的药物分子，例如薄荷醇、紫杉醇、青蒿素等。萜类化合物的天然合成途径是高度模块化的（图1）。首先，两种C5单元IPP和DMAPP在酶催化下连接得到C10单元GPP。进一步地，IPP与GPP继续连接，得到C15单元FPP，FPP继续与IPP连接得到C20单元GGPP。然后，在各类萜的合酶催化下，GPP被用于合成单萜骨架，FPP被用于合成倍半萜和三萜骨架，而GGPP被用于合成二萜和类胡萝卜素化合物骨架。这些骨架经过一系列酶的氧化还原修饰，最终得到各种萜类天然产物。
图1. 萜类化合物的天然合成途径。 绝大多数萜类分子的碳原子数量都是5的倍数，这是因为组成其分子骨架的基本单元中，大多数碳原子数量也是5的倍数。GPP、FPP、GGPP因此被称为萜类化合物的canonical building blocks。那么是否存在碳原子数量非5的倍数的non-canonical building blocks，以及利用它们进行萜类生物合成的代谢途径呢？来自哥本哈根大学的Sotirios C. Kampranis课题组曾于2018年在酵母中成功合成了以C11 building blocks为基础的非天然萜类分子[2]。最近该课题组借助相似的研究思路，又在酵母中成功合成了一系列以C16 building blocks为基础的非天然萜类分子（图2），相关工作于9月3日发表在Nature Communications中 [1]。
图2. 以C16 building blocks为基础的非天然萜类化合物家族。 ——作者简介—— Sotirios C. Kampranis教授来自丹麦哥本哈根大学植物与环境科学学院植物生物化学系，长期致力于发展针对复杂化学分子的生物合成方法，课题组主要研究方向包括：植物生物代谢中的酶工程学；用于合成高附加值化合物、特别是萜类、大麻素类和生物碱的酵母代谢工程；结合蛋白质工程与代谢工程合成非天然代谢物；识别植物代谢物的酵母生物传感器；基于定向进化的细胞工厂改良与酶的优化等。 ——方法与结果—— 在酵母中建立PSPP的合成代谢系统： 作者首先在酵母体内建立了能合成一种C16building block PSPP(1，图3)的代谢系统。作者注意到有研究发现了一种独特的甲基转移酶SpSodMT[3]，这种酶可以连续催化FPP的甲基化和环化反应，产生含16个碳的萜类基本单元PSPP。作者受到启发，将SpSodMT转入一种能大量合成FPP的酵母品种AM109中，发现其在酵母中可以催化相同的反应产生PSPP，并用GC-MS鉴定出PSPP进一步反应产生的三种新化合物1a、1b和1c（图3）。更进一步实验证明，引入SpSodMT不会干扰酵母细胞内其他正常的代谢过程，因此SpSodMT的催化是生物正交的。
图3. PSPP(1)与化合物1a、1b、1c的化学结构。 设计全新C16 building blocks的合成途径： 下一步，作者希望获得与PSPP结构不同的全新C16 building blocks。作者根据SpSodMT的催化机理（图4a），用点突变方法进行蛋白质理性设计。作者利用与SpSodMT同源的去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶-FPP复合物结构（PDB ID: 5kok），用同源建模得到了SpSodMT的酶结构（图4b），再与底物FPP进行分子对接，找到了催化活性口袋中可能影响反应进行的关键残基共10个。作者进一步对这些残基位点进行点突变，建立55个单位点突变体组成的库，并从中筛选出可以产生全新C16 building block的突变体。实验表明仅有5个残基的单点突变能改变酶催化的反应类型（图4b）。作者从这些单突变体的催化反应产物中推断出6种全新C16 building blocks: PPP(2)、TPP(3)、WPP(4)、BPP(5)、KPP(6)和HPP(9)（图4a）。作者又对5个残基中的4个设计了第二轮点突变，建立15个双位点突变体组成的库，并从有催化活性的突变体的催化产物中又推断出3个全新C16 building blocks SPP(7)、JPP(8)和APP(10)（图4a）。
图4 a. SpSodMT的催化机理与10种building blocks的结构；b. SpSodMT-FPP复合物对接结构，影响反应过程的5个残基在图中已标出。SAH：S-腺苷-L-高半胱氨酸。 从全新C16 building blocks合成非天然萜类分子： 得到10种非天然building blocks后，作者需要找到适合这些底物的萜类合酶。作者首先尝试了以FPP为底物的合酶但并未成功，这可能是因为酶的催化口袋过小。作者转而寻找催化口袋更大的二萜合酶种类，并成功找到了两种催化机理不同但均有活性的二萜合酶Cyc2和HaKS。实验表明Cyc2能将building blocks 1-4转化为对应的共轭二烯，而HaKS能将building blocks 1-10转化为对应的三级醇（图5）。其中HaKS催化活性较高，能以59.3mg/L的产量合成1b，因此作者选择HaKS的产物进行后续的氧化酶筛选实验。
图5. Cyc2和HaKS的催化机理和催化产物结构。 在氧化酶筛选实验中，作者希望找到一种合适的细胞色素P450酶，可以对上一步HaKS产生的萜类做进一步氧化。作者筛选出一种酶CYP720B1(PtAO)，可以将化合物1b和3b分别氧化为13OH-1b和9OH-3b（图6）。除此之外，作者还观察到五种未知的氧化产物11-15，因难以分离故未能鉴定结构。
图6. 13-OH-1b和9-OH-3b的化学结构。 通过以上实验，作者最终得到了10种非天然的C16 building blocks和28种结构已知的非天然萜类。有趣的是，作者发现其中4种化合物具有特殊的气味，结果列于表1中。 表1. 4种化合物的气味
——小结—— 作者的工作设计并实现了一种在酵母中基于C16building blocks合成非天然萜类化合物的代谢途径，在天然产物类似物的生物合成方面做出了理念上的进一步创新。作者通过酶工程和代谢工程，成功让酵母合成了自然界不存在的“天然产物”，极大拓宽了我们对生物可合成分子的认知，强烈暗示存在许多大自然和化学家都未曾触及的化合物。这项工作告诉我们，合成生物学也能像化学一样，成为探索未知化学空间的有力工具。 参考文献： [1] Ignea, Codruta, et al. "Expanding the Terpene Biosynthetic Code with Non-Canonical 16 Carbon Atom Building Blocks." Nature Communications 13.1 (2022): 5188. DOI: 10.1038/s41467-022-32921-w [2] Ignea, Codruta, et al. "Synthesis of 11-Carbon Terpenoids in Yeast Using Protein and Metabolic Engineering." Nature Chemical Biology 14.12 (2018): 1090-98. DOI: 10.1038/s41589-018-0166-5 [3] von Reuss, Stephan, et al. "Sodorifen Biosynthesis in the Rhizobacterium Serratia Plymuthica Involves Methylation and Cyclization of Mep-Derived Farnesyl Pyrophosphate by a Sam-Dependent C-Methyltransferase." Journal of the American Chemical Society 140.37 (2018): 11855-62. DOI: 10.1021/jacs.8b08510 |
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