1996 年，初代基因编辑工具开发成功。如今，有着“基因魔剪”之称的 CRISPR-Cas9 已经成为继 ZFN、TALEN 等之后的第三代基因编辑工具，相较于前两代，它具有效率高、成本低、易于组装等一系列优势。2020 年，CRISPR-Cas9 基因编辑技术获得诺贝尔化学奖。虽然 CRISPR-Cas9 是目前最主流的基因编辑工具，广泛用于多种细胞类型的基因编辑，但它在干细胞中存在递送和编辑效率低等挑战。近日，宾夕法尼亚州立大学的研究小组开发了一种基于修饰 mRNA 的 CRIPSR-Cas9 系统应用于人类多能干细胞，使其在干细胞中的基因编辑效率提高到 84%，而且还减少了脱靶效应。（来源：Cell Reports Methods）“相较于其他基因编辑工具，CRISPR-Cas9 在降低成本的同时提高了精准度，但在干细胞中使用 CRISPR-Cas9 是当今面临的一大挑战，将其递送到干细胞存在效率低下、成本高昂以及耗费时间等诸多难题。我们开发的这种新方法大幅提高了 CRISPR-Cas9 在人类多能干细胞中的递送和编辑效率，能够更好地推进其在遗传疾病的诊断和治疗方面的广泛应用。”该论文的通讯作者、宾夕法尼亚州立大学生物医学工程和生物学系练小军说道。练小军本科毕业于浙江大学，随后，他进入威斯康星大学麦迪逊分校并获得化学和生物工程博士学位。毕业后他先后进入哈佛大学和卡罗琳斯卡研究所从事博士后研究工作，研究方向主要围绕干细胞与再生生物学、细胞和分子生物学等。练小军曾获得 2012 年度美国国家科学院 Cozzarelli 奖、2017 年度 BMES 高级生物制造初级研究员奖。▲图｜宾夕法尼亚州立大学生物医学工程和生物学系练小军博士（来源：Penn State）“基于修饰 mRNA 的 CRIPSR 系统基因编辑效率提高到 84%”在 CRISPR-Cas 家族中，Cas9 是最常使用的核酸内切酶。CRISPR-Cas9 系统使研究人员能够对基因精确位置来进行切割，为创造新的诊断工具和纠正基因突变来治疗遗传疾病提供了新的手段。“人类基因组是非常庞大的，CRISPR-Cas9 让我们有可能找到并瞄准突变基因来进行研究。”练小军表示。寻找一种敲除干细胞基因的有效方法，对于探索干细胞分化过程中基因的功能是必不可少的步骤。在练小军看来，目前基于质粒 DNA 的传统 CRISPR-Cas9 系统在干细胞中面临递送和编辑效率问题。“传统 CRISPR-Cas9 系统的递送效率较低，大约只有 20%-30% 的靶细胞会接受基因编辑质粒 DNA。相比之下，将 RNA 递送到细胞中是一种更为高效的方式，然而当引入常规 RNA 时，细胞会将其视为病毒并进行攻击。”他说道。▲图｜新方法提供了更高的基因编辑效率且没有载体插入人类细胞基因组的风险（来源：Penn State）对此，练小军团队改变了基因编辑工具递送到干细胞的方式，他们使用的是经过修饰的 RNA（modRNA）。这种 modRNA 与常规质粒 DNA 的不同之处在于，它用化学修饰的形式取代了 RNA 中的一种基本底物，并通过更强的结构支持使其保持稳定。“我们发现 modRNA 比质粒 DNA 更加高效，大约 90% 的细胞通过简单的转染获得了 modRNA，因此它能够保持原位并发挥作用。”练小军指出。“此外，这种 modRNA 存在的时间也'恰到好处’，既有足够长的时间来修饰细胞，而且也不会存在过长时间导致脱靶。”然而，modRNA 又引入了另一个问题。当 modRNA Cas9 成功递送到靶基因之后，它会在基因组中产生双链断裂。“我们发现大多数有这种双链断裂的细胞会将其识别为基因组出现问题并启动'自毁程序’，而不是试图自我修复。”练小军说道。为了减少 Cas9 的副作用并帮助编辑后的细胞存活，练小军团队加入了一种小蛋白来帮助细胞生长。“我们添加蛋白之后不但抑制了细胞死亡，而且将 Cas9 编辑效率提高了 84%。”他指出。▲图｜使用 Cas9 modRNA 可有效敲除人类多能干细胞中的整合绿色荧光蛋白（来源：Cell Reports Methods）除此之外，练小军团队还发现，modRNA 可以改进其他基因编辑技术，比如碱基编辑。碱基编辑可以通过使用一种蛋白质来改变单核苷酸而不是像 CRISPR 那样切割双链来敲除基因或纠正基因突变。“我们采用基于 modRNA 和质粒 DNA 的碱基编辑蛋白分别转染干细胞。”他说，“在基因编辑效率上，基于 modRNA 的方法的效率达到达到 68%，基于质粒 DNA 的方法效率约 16%，前者是后者的 4 倍多。”人类多能干细胞（hPSC）是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞，具有产生人体各种类型细胞的能力，是当前干细胞研究领域的热点，而把人类多能干细胞与 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的结合研究，能够加速各种人类疾病建模和创新药物筛选进程。“将干细胞技术和基因编辑工具结合在一起，我们可以在干细胞中创建疾病相关突变，然后在实验室的培养皿中高效快速地研究人类疾病而无需患者自身的细胞。此外，编码蛋白质的人类基因数量超过 2 万个，但我们仅仅才研究了其中大约 10% 基因的功能。若是检测每个剩余基因的目的需要花费太多的时间，而使用我们高效基因编辑技术中的工程干细胞可以大幅加快这一过程。”练小军总结说。“基因编辑与干细胞结合加速疾病建模与药物开发”自从 1953 年沃森和克里克发现了 DNA 双螺旋结构，人类开始走上了破译生命密码之路。基因是一切生命活动的根本，只要找到靶基因，就能针对性地开展该基因的功能、机制、表达等一系列研究，这对于各种罕见病、遗传病的治疗具有革命性的意义。基因编辑便是一种对靶基因进行敲除、敲入以及定点突变等精确修饰的基因工程技术。目前，主流的基因编辑工具包括锌指核酸酶技术（ZFN）、转录激活效应因子核酸酶技术（TALEN）以及 CRISPR-Cas9 技术。CRISPR-Cas9 系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用来对抗入侵病毒以及外源 DNA。天然 CRISPR-Cas9 系统主要由 Cas9蛋白、crRNA、tracrRNA 三部分构成，其中，crRNA 和 tracrRNA 通过局部碱基配对的方式组成 gRNA，其与 Cas9 蛋白结合并引导 Cas9 蛋白识别和切割靶基因序列。为了提高 gRNA 稳定性和简化操作，诺奖得主 Jennifer Doudna 和团队把 crRNA 和 tracrRNA 融合成一条 RNA（sgRNA）。这种改造后的 CRISPR-Cas9 系统是目前应用最为广泛的基因编辑工具，不仅可用于基因表达调控研究、细胞动物模型构建、药物靶点筛选，而且在基因治疗中展现出巨大的发展前景，为多种疾病提供了新的治疗方法，如肿瘤、血液病和各种遗传疾病等。以肿瘤治疗为例，通过 CRISPR-Cas9 系统改造得到的 T 细胞已经开始应用于免疫疗法，比如 CAR-T 细胞疗法。该疗法在白血病、淋巴瘤和部分实体瘤中有很好的发展前景，利用 CRISPR-Cas9 系统同时敲除多个基因位点，产生具有缺陷的 CAR-T 细胞能够有效减少移植物抗宿主病和免疫排斥反应，为开发通用型 CAR-T 细胞疗法打下基础。据数据显示，截至目前已知的遗传性疾病达 7000 余种，但绝大部分疾病都缺乏有效的治疗药物和方法。如今，以 CRISPR-Cas9 为代表的基因编辑工具为这类疾病的治疗带来了希望，通过对靶基因进行定点替换、敲除或敲入等操作，实现在分子水平上对致病基因进行编辑和修改，能够治疗各种遗传性疾病以及先前没有治疗药物的疑难杂症。虽然 CRISPR-Cas9 系统优势众多，但现阶段也存在一些局限性，比如脱靶效应、安全问题等。相信随着技术的不断发展，CRISPR-Cas9 系统也会日渐完善。正如上文介绍的把基因编辑和干细胞相结合，即可在培养皿中高效快速地研究人类疾病、进行药物筛选等，进一步加速各种疾病建模和创新药物开发进程。2.https://www./news/engineering/story/new-approach-more-doubles--cell-editing-efficiency-researchers-report3.https://baike.baidu.com/item/CRISPR-Cas9/18441813?fr=aladdin
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