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文章信息 题目：Tomato CRABS CLAW paralogues interact with chromatin remodelling factors to mediate carpel development and floral determinacy 刊名：New Phytologist 作者：Laura Castañeda et al. 单位：Universidad de Almería 日期：16 February 2022 摘要 1 CRABS CLAW ( CRC ) 的直系同源物在被子植物的花分生组织 (FM) 确定和雌蕊形成中发挥着至关重要的作用，这是确保植物成功繁殖和作物生产的关键发育过程。然而， CRC介导的FM终止背后的机制远未完全理解。 在这里，我们讨论了番茄 ( Solanum lycopersicum ) 旁系同源CRC基因的功能表征。使用测序、RNA 干扰和 CRISPR/Cas9 技术、表达分析、蛋白质-蛋白质相互作用测定和拟南芥互补实验，我们检查了它们在 FM 确定性和心皮形成中的潜在作用。 我们发现，在果实迭代生长突变植物中观察到的不确定心皮内心皮表型的不完全外显率和可变表达性是由于番茄CRC同源物SlCRCa缺乏。此外，对番茄CRC旁系同源物SlCRCa和SlCRCb的详细功能分析，使我们能够提出它们作为 FM 确定性的正调节剂，通过补偿和冗余的方式保护花朵和果实的正常形成。 我们的研究结果首次揭示了假定的 CRC 直系同源物与染色质重塑复合物成员的物理相互作用，染色质重塑复合物通过组蛋白去乙酰化在表观遗传上抑制WUSCHEL表达，以确保正确终止花干细胞活性。 技术路线 2  通过将fig突变体与野生番茄Solanum pimpinellifolium杂交并使 F 1植物自花授粉产生 F 2作图群体。 番茄花和果实的表型特征 全基因组测序和候选基因鉴定 定量实时 PCR 番茄转基因系的产生 原位杂交分析 RNA测序 拟南芥crc-1突变体的分子互补 免疫共沉淀测定 亚细胞定位和双分子荧光互补测定 主要结果 3 3.1 果实重复生长突变损害心皮的形成 果实重复生长( fig ) 突变体是从番茄品种 P73 产生的一组 T 1分离 T-DNA 系的筛选中分离出来的。fig植物的营养发育与WT植物的营养发育没有区别，而在花和果实发育过程中观察到显着差异（图 1a-c；表 S5）。fig花在所有轮生中的器官数量增加，这种增加在心皮中更为明显。因此，心皮的形成在fig的雌蕊中反复发生花导致异常果实，显示次生果实结构以不确定的方式生长，从主要果实内部出现（图 1a-c；表 S5）。 尽管 367 bp 插入发生在非编码区，但我们认为Solyc01g010240基因是造成fig表型的强有力候选基因，因为它是拟南芥CRC基因SlCRCa的同源物，它是假定的 YABBY 转录因子先前描述的基因家族参与心皮和蜜腺发育和 FM 测定。为了确定 LTR 插入对SlCRCa表达的影响，进行了 cDNA 克隆和 qRT-PCR 分析。WT 和突变 cDNA 的序列相同，但SICRCa在 0-6 和 7-12 阶段，fig突变体的花蕾中的表达显着降低（图 2c）。因此，367-bp 的插入将SlCRCa转录水平降低至 > 2 倍，但仍允许产生 WT SlCRCa mRNA，这表明第四个SlCRCa内含子可能包含对维持SlCRCa时空表达模式至关重要的转录调控元件。
为了证实SlCRCa功能的缺乏是否是导致fig表型的原因，我们生成了具有降低水平的SlCRCa转录物的 RNAi 介导的敲低系。评估了四个独立的第一代 (T 0 ) RNAi SlCRCa二倍体系，其显示在 0-6 阶段的花芽中SlCRCa表达下降 > 2 倍（图 2d）。与无花果突变一样，RNAi SlCRCa系显示出可变范围的花表型，导致果实发育为具有 WT 样、弱和严重的不确定表型（图 2e、f）。此外，我们使用具有靶向 SlCRCa 第二外显子的sgRNA的 CRISPR/Cas9 系统设计了敲除突变（图 2g）。我们评估了四个独立的 T 0二倍体系（CR -slcrca），它们是编辑的敲除等位基因的双等位基因（图 2g）。CR- slcrca系发育花和果实，这无疑类似于在无花果突变体中观察到的表型，并且它们还产生广泛多样的开花和不确定的果实表型，其中大多数被归类为严重（图 2f，h）。因此，尽管具有严重突变表型的水果百分比存在差异，但敲低（RNAi）和敲除（CRISPR / Cas9）等位基因导致相似的表型具有不完全外显率和可变表达性，表明SlCRCa功能的任何缺陷可能导致FM确定性的丧失。
Fig. 2 3.2 SlCRCa表达仅限于心皮 正如从fig表型所预期的那样， SlCRCa表达主要局限于早期发育阶段的花朵。在 0-6 阶段的花蕾中发现了更高的SlCRCa表达（图 3a）。RNA原位杂交分析表明，当SlCRCa转录物在花期3开始时，它们在心皮原基中特异性积累（图 3b），并在花期6时持续存在于这些原基中，此时心皮正在长大，胎盘原基出现（图 3c）。在花期 8，SlCRCa表达位于卵巢壁基部的近轴表面，以及发育中的雌蕊群的最远端细胞中，这将产生花柱和柱头（图 3d）。然而，在花期9的卵巢壁中未检测到SlCRCa mRNA，其表达仍保留在雌蕊的远端（图 3e）。在花发育的后期，没有证据表明可检测到SlCRCa转录本。 接下来在发育阶段 0-6 的 WT 和无花果花蕾上进行 RNA-seq，以深入了解SlCRCa的功能作用。与 WT 相比，该分析确定了无花果中的2115个 DEG ，其中 978 个上调，1137 个下调（表 S6）。为了研究 DEG 的功能，我们应用了 GO 富集分析，该分析分别揭示了 29 个和 36 个过度代表的 GO 用于上调和下调的 DEG（表 S7）。对于生物过程，属于对刺激反应的 GO （GO：0050896）在两组 DEG 中都得到了富集。然而，与繁殖有关的生物过程（GO：0000003）、繁殖过程（GO：0022414）、涉及繁殖的发育过程（GO：0003006）、生殖结构发育（GO：0048608）和花发育（GO：0009908）被富集在了在上调的 DEG 中。关于分子功能，参与蛋白质结合的 GO 术语（GO：0005515）在上调和下调的 DEG 中均富集。此外，转运蛋白活性（GO：0005215）和序列特异性 DNA 结合的转录因子活性（GO：0003700）在上调的 DEG 中富集（表 S7；图 S3）。 在带有生殖结构发育（GO：0003700）和花发育（GO：0009908）术语注释的上调DEG中，我们发现了拟南芥PIN-FORMED生长素外排载体（Solyc03g118740，Solyc04g007690和Solyc05g008060）和AUXIN的同源物RESPONSE FACTOR 转录因子（Solyc09g007810 和 Solyc12g042070）家族，以及花同源基因APETALA2（Solyc02g064960）、APETALA3（Solyc04g081000） 、 FRUITFULL（Solyc03g114830）和SEPALLATA4（Solyc03）的同源物，后者也参与其中FM 的测定。在这组基因中，我们还发现了拟南芥HECATE3 ( Solyc11g005780 ) 的同源物，其过表达导致异位柱头组织的产生 (Gremski et al ., 2007 )。值得注意的是，拟南芥CRC基因的第二个同源物（ SlCRCb，Solyc05g012050）也包含在这组上调的DEG中。
Fig. 3 3.3 SlCRCb中的敲除突变模拟fig突变表型 虽然拟南芥基因组携带一个CRC基因拷贝，但茄科的祖先复制产生了两个旁系同源物CRCa和CRCb，它们在茄科基因组中的保留表明功能相关。拟南芥 CRC (181 aa) 和番茄 SlCRCa (173 aa) 和 SlCRCb (160 aa) 氨基酸序列的序列分析表明，CRC 与 SlCRCa 和 SlCRCb 的同一性分别为 64% 和 68%；而 SlCRCa 与 SlCRCb 有 73% 的同一性。拟南芥和番茄中含有CRC基因的基因组块之间的微同线性研究表明，含有CRC的拟南芥基因组区域与携带SlCRCb而不是SlCRCa的番茄中的基因更密切相关（图 S4）。为了进一步了解SlCRCb的作用，我们检查了它的时空表达。与SlCRCa 一样，在生殖组织中观察到SlCRCb的特异性表达（图 3a，f），尽管SlCRCb转录物在所有花发育阶段都被检测到，从发育阶段 0-6 的花芽到开花后 10 天的花（图 3f），而SlCRCa表达主要在花芽发育的第一阶段检测到（图 3a）。尽管SlCRCa和SlCRCb显示出不同的时间表达模式，但在发育花中的原位杂交研究表明，SlCRCb显示出与SlCRCa相同的空间表达谱。因此，SlCRCb转录物积累首先定位于心皮原基的花期 3（图 3g），在那里它一直持续到花期 6（图 3h）。随着发育进展到花期 8，在卵巢壁和发育中雌蕊的远端区域检测到SlCRCb表达（图 3i），其表达在花期9时仍然受到限制（图 3j）。 SlCRCa基因座突变的不完全外显率和可变表达性，以及在雌蕊发育开始时重叠的SlCRCa和SlCRCb空间表达模式，导致了番茄CRC旁系同源物可能存在部分冗余的假设。为了验证这一假设，我们使用 CRISPR/Cas9 系统产生了敲除突变，其中 sgRNA 靶向 SlCRCb 的第二个外显子（图 4a）。我们评估了四个独立的 T 0二倍体系 (CR -slcrcb ) 纯合子或双等位基因的编辑敲除等位基因（图 4a）。CR -slcrcb品系产生的花的子房由许多相互生长的心皮组成，这导致了与在无花果突变体、RNAi SlCRCa和 CR -slcrca品系中观察到的类似的异常果实（图 4b）。CR- slcrcb系也产生了广泛多样的花和不确定的果实表型，尽管具有弱或严重突变表型的果实的存在不超过50％，具有严重突变表型的果实的百分比接近15％（图 4c ）。这些结果表明，SlCRCa和SlCRCb在 FM 确定性中可能具有部分冗余作用。
Fig. 4 考虑到RNA-seq结果显示SlCRCb在无花果花蕾中上调，问题是番茄CRC旁系同源物之间的补偿机制是否可能参与雌蕊的测定。为此，分别在slcrcb和slcrca CRISPR/Cas9 无效突变体的生殖组织中量化了SlCRCa和SlCRCb的表达。SlCRCb在发育阶段 0-6 的 CR- slcrca花芽中差异上调（图 4d）。SlCRCb在 CR- slcrca中也被上调在花发育期间从花芽到开花日，而SlCRCa转录物在发育阶段 0-6 的 CR- slcrcb花芽中上调（图 4d）。此外，我们生成了 CR - slcrca:slcrcb双突变植物，以进一步剖析番茄CRC旁系同源物之间的关系。值得注意的是，SlCRCa和SlCRCb功能的同时丧失导致影响心皮发育的同源异变改变，因为它的一些细胞的形状达到了雄蕊样性质（图 4e，S5）。CR- slcrca:slcrcb花以重复模式产生雄蕊状心皮，仅影响第四轮，从而形成具有严重不确定表型的果实（图 4f，g），在所有情况下都比CR- slcrca 或CR- slcrcb严重得多单突变体。因此，当两个番茄旁系同源物都失去功能时，发现了完全的外显率和不变的表现力。 3.4 番茄 CRC 旁系同源物与抑制SlWUS表达的染色质重塑复合物成员结合 花决定性需要抑制干细胞身份基因SlWUS；因此，我们通过检测SlWUS的时空表达，进一步研究了番茄CRC旁系同源物在 FM 测定中的作用。在 WT 花中，组织中心的SlWUS表达从早期 FM 发育阶段被检测到，直到在心皮原基开始出现的第 4-5 阶段，干细胞活性在花蕾中被抑制（图5a ). 从第 6 阶段开始，SlWUS在 WT 发育的心皮中信号被完全消除。然而，在第 6 阶段的 CR -slcrca和 CR -slcrcb花芽中，在生长但仍未融合的心皮原基之间检测到了SlWUS转录物。在胎盘中的一小群细胞中甚至在后期阶段观察到了SlWUS表达，其中可能会发生新的心皮原基的启动（图 5a）。在 CR -slcrca:slcrcb花中观察到扩大的SlWUS表达域导致 FM 大小增加，这与双突变心皮中发现的严重不确定性一致（图 5a）。因此，SlWUS的扩展表达式与 CR -slcrc系的花不确定性表型相关，表明番茄CRC旁系同源物可能参与调节SlWUS转录，限制 FM 活性并促进花确定性。 番茄花干细胞活性的完全终止是由染色质重塑复合物介导的，该复合物由 SlIMA (Solyc02g087970)、SlKNU (Solyc02g160370)、SlTPL (Solyc01g100050) 和 SlHDA1 (Solyc09g091440) 组成，它能够抑制SlWUS。由于SlWUS表达在 CR- slcrca和 CR- slcrcb不定花中被错误调节，我们想知道番茄CRC是否旁系同源物可能是这种调节途径的一部分。由于 SlKNU、SlIMA、SlTPL1 和 SlHDA1 显示核定位，我们首先通过瞬时表达 SlCRCa 和 SlCRCb 的 N 端 GFP 标记版本来评估 SlCRCa 和 SlCRCb 亚细胞定位。共聚焦显微镜分析揭示了两种蛋白质的独特核定位（图 5b）。接下来，我们进行了附设分析，以评估番茄 CRC paralogues 是否可能在植物中发生物理相互作用染色质重塑复合体成员包括 SlKNU、SlIMA、SlTPL1 和 SlHDA1。正如在表皮细胞核中观察到的 YFP 信号所指出的，SlCRCa 和 SlCRCb 能够相互物理相互作用，并且它们中的每一个依次与 SlKNU、SlIMA 和 SlHDA1。此外，发现 SlCRCb 而不是 SlCRCa，与 SlTPL1 结合（图 5c）。在相反方向的 BiFC 实验也证实了 SlCRCa 和 SlTPL1 之间缺乏相互作用（图 S6）。上述相互作用进一步得到免疫共沉淀 (CoIP) 研究的证实（图 5d），证明 SlCRCa 和 SlCRCb 可以物理结合染色质重塑复合物成员，进而抑制SlWUS表达以促进FM确定性。
3.5 番茄CRC旁系同源物部分挽救了拟南芥CRC基因的功能丧失 在拟南芥中，CRC中的突变影响雌蕊发育，其无法在顶端融合，使其比 WT 更宽和更短。由于番茄CRC旁系同源物似乎具有部分冗余功能，我们接下来质疑它们是否能够补充拟南芥crc突变体的表型缺陷。因此，在拟南芥CRC启动子控制下，用SlCRCa或SlCRCb编码序列遗传转化了crc-1突变体。对于这些实验，来自拟南芥CRC起始密码子上游的 3860-bp 片段被用作启动子序列，因为它的功能性先前已被证明。与WT L er植物相比，crc-1表现出未融合的心皮和蜜腺发育的取消，以及相当短和宽的长角果（图 6）pCRC :: SlCRCa和pCRC :: SlCRCb转基因能够完全恢复心皮融合（图 1 6c）和角果长度略有增加（图 6a，b）。与番茄花中缺乏蜜腺一致，SlCRCa和SlCRCb没有挽救crc-1中的蜜腺发育（图 6d）。作为对照，WT L er植物也用pCRC :: SlCRCa或pCRC :: SlCRCb 转化，其与未转化的 L er植物没有显着差异（图 S7）。总的来说，我们的结果表明番茄CRC当转化成crc-1植物时，旁系同源物能够部分恢复 WT 表型。
Fig. 6 结论 4 在这里，我们提供了对 FM 确定性和心皮发育所涉及的遗传和分子机制的见解。我们的研究结果表明，在果实迭代生长( fig ) 突变体中观察到心皮确定性的丧失是由于番茄CRC同源物SlCRCa缺乏功能。此外，番茄CRC旁系同源物SlCRCa和SlCRCb的功能分析使我们首次揭示了CRC直系同源物作为表观遗传抑制WUS的分子网络成员的作用通过组蛋白去乙酰化来确保花干细胞活性的适当终止。 获取原文 5 原文链接： https://nph.onlinelibrary./doi/10.1111/nph.18034  END   06 广告 |
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