|
生科云网址：https://www./
编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
微科盟原创微文，欢迎转发转载。 导读
2型糖尿病（T2D）被认为是全球最重要的代谢综合征之一，长期使用已经上市的T2D药物往往会产生一些副作用。桑叶（ML）在综合治疗功效方面具有优势，具有多组分、多靶点、多通路、与糖尿病复杂病理机制相匹配的特点。在本研究中，我们对T2D大鼠采用高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素处理；除利用代谢组学技术外，结合空腹血糖等指标评价ML的降血糖作用，我们分析了大鼠血清代谢物变化。MLs显著降低T2D大鼠的空腹血糖，同时改善多食和多尿症状。ML处理改变了T2D大鼠血清中各种代谢物的水平，这些代谢物涉及多种代谢途径（氨基酸代谢、碳水化合物代谢和脂质代谢），在抗氧化应激和抗炎、调节免疫和糖异生过程以及改善肥胖和胰岛素抵抗（IR）中发挥作用。ML含有多种化学成分，代谢组学结果表明MLs调节多种代谢途径发挥降血糖作用，表明MLs可能在开发新的降血糖药物方面具有很大的前景。
原名：Therapeutic mechanisms of mulberry
leaves in type 2 diabetes based on metabolomics期刊：Frontiers in Pharmacology
我们使用UPLC-Q-Exactive
OrbitrapMS检测MLs，并获得正离子和负离子模式下的总离子色谱（TIC），如图1所示。结合化合物结构、数据库和文献，MLs提取物中共鉴定出61种化合物，其中正离子模式27种，负离子模式34种。含有黄酮类16种、有机酸21种、酚类9种、生物碱3种、香豆素3种、其他9种；61种化合物的定性表显示在补充表S1中。
图1 通过UPLC-Q-Exactive
Orbitrap-MS（A）测定MLs的组成。正离子模式下MLs的总离子流图（B）。负离子模式下MLs的总离子流图（C）。正负离子模式下UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS鉴定MLs中单体组分的数量。MLs中共鉴定出16种黄酮类化合物，包括芦丁（1）、槲皮素（2）、山柰酚、木犀草素（4）、cymaroside（5）、山柰酚-3-o-芸香苷（6）、金丝桃苷（7）、异槲皮素（8）、槲皮苷（9）、紫云英苷（10）、morin （11）、桑辛素O （12）、桑辛素M（13）、桑黄酮（14）、补骨脂乙素（15）和樱花素（16）。异槲皮苷（标准化合物）的元素组成为C21H20O12（ppm = -1.73），其分子离子峰在HESI负离子模式下位于m/z 463.08899，并在MS2中产生m/z 301.03离子碎片，表明异槲皮苷破坏了C环3位羟基上的糖苷键，生成m/z 301 [M-H-C6H11O5]-片段，然后是m/z 271 [M-H-C6H11O5-CO]-片段，裂解行为如图2A所示。结合标准化合物质谱裂解图，我们推测化合物8为异槲皮苷。化合物2的分子离子峰[M + H]+为m/z 303.05032，我们推测其元素组成为C15H10O7（ppm = -1.32）。二级质谱[M-H]-产生碎片离子m/z 229.05 [M +
H-2CO-HO2]+和m/z 153.02 [M + H-2C8H6O3]+；结合文献，我们推测化合物2为槲皮素，裂解图如图2B所示。
图2 MLs的某些化学成分如（A）异槲皮苷、（B）槲皮素、（C）咖啡酸、（D）香草酸、（E）桑皮苷A、（F）1-脱氧野尻霉素和（G）7-羟基香豆素的质谱裂解图。我们共鉴定出21种有机酸化合物，包括香草酸（17）、原儿茶酸（18）、咖啡酸（19）、绿原酸（20）、2-羟基肉桂酸（21）、反式肉桂酸（22）、奎尼酸（23）、2,3,4-三羟基苯甲酸酯（24）、3,4,5-三羟基苯甲酸（25）、肉豆蔻酸（26）、4-胍基丁酸（27）、苹果酸（28）、莽草酸（29）、柠檬酸（30）、α-亚麻酸（31）、异绿原酸C（32）、异绿原酸B（33）、9-12-二氧十二烷酸（34）、corchorifatty acid
F（35）、脱落酸（36）和隐绿原酸（37）。咖啡酸（标准化合物）的元素组成为C9H8O4（ppm = 0.06），并且其在HESI负离子模式下的分子离子峰为m/z 179.03497，在MS2中产生m/z 135.05片段，表明它脱羧基产生135.03 [M-H-COOH]-片段，具体裂解过程如图2C所示。化合物19的裂解模式被推测为咖啡酸。化合物17的分子离子峰[M-H]-为m/z 167.03462，我们推测其元素组成为C8H8O4（ppm = 2.16），在MS/MS中产生m/z 123.04523
[M-H-OCH4]-以及m/z 108.02171 [M-H-OCH4]-碎片离子；结合文献，化合物17被推测为异香草酸，裂解模式如图2D所示。
图3 ML处理前后大鼠空腹血糖、体重、食物及饮水量。（A）空腹血糖、（B）空腹体重、（C）食物摄入量和（D）水摄入量。数据表示为平均值± SEM，n ≥ 7。#p < 0.05对比对照组，##p < 0.01对比对照组，*p < 0.05 对比T2D组，**p < 0.05对比T2D组。我们共鉴定出九种酚类化合物，包括丁香酚（38）、丁香脂素（39）、桑辛素 A （40）、桑辛素 P（41）、桑辛素 C（42）、4-[2-（3,5-dihydroxyphenyl）ethenyl]benzo-1,3-diol（43）、桑皮苷A（44）、氧白藜芦醇2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（45）和6-姜酚（46）。化合物44的分子离子峰[M-H]-为m/z 567.17242，二级质谱显示m/z 405.12036 [M-H-162]-、243.06654和其他碎片离子的丰度很高，它可以与白藜芦醇类似的方式被氧化；结合化工专业数据库及相关文献，我们推测该化合物为桑皮苷A。裂解模式如图2E所示。
图4 正离子模式（A）以及负离子模式下（B）的血清代谢组学分析的主成分分析（PCA）评分图我们共鉴定出三种生物碱，包括1-脱氧野尻霉素（47）、葫芦巴碱（48）和鹅掌楸苦素（49）。1-脱氧野尻霉素（标准化合物）的元素组成为C6H13NO4（ppm = -0.67），它在HESI正离子模式下显示其分子离子峰为m/z 164.09184，在MS2中产生m/z 146.08、82.07和69.03的片段，表明1-脱氧野尻霉素首先脱去一个羟基，生成一个146.08 [M + H-OH]+片段，然后是一个96.05 [M + H-（OH）3]+片段；同时，1-脱氧野尻霉素可能会丢失一个CH6O4以产生82.07 [M + H-CH6O4]+片段，接着是69.03 [M + H-CH6O4-CH]+片段。裂解行为如图2F所示。我们共鉴定出三种香豆素，包括5,7-二羟基香豆素（50）、skimmetin（51）和东莨菪素（52）。7-羟基香豆素（标准化合物）作为一种简单的香豆素分子，元素组成为C9H6O3（ppm = -0.12），其分子离子峰在HESI负离子模式下位于m/z 161.02443，MS2中几乎不产生碎裂，二级质谱中有一个小峰，以分子离子峰为基峰，产生133.03[M-H-CO]-碎裂的小峰；裂解模式如图2G所示。我们还鉴定了其他九类化合物，包括肉桂醇（53）、肉桂醛（54）、香草醛（55）、L（+）-鼠李糖一水合物（56）、亚麻苦苷（57）、鸟苷（58）、藁本内酯（59）、植物鞘氨醇（60）和psychosine（61）。
图5 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）得分图，（A-D）正离子模式和（E-H）负离子模式血清代谢组学分析的S图。我们之前的研究表明，MLs显著改善了T2D大鼠的口服葡萄糖耐量试验（OGTT）、胰岛素耐量试验（ITT）、血清胰岛素等指标，调节血糖代谢，提高糖耐量，增强胰岛功能，改善胰岛素抵抗，降低血脂水平，抑制炎症因子表达，改善T2D症状。因此，我们在本实验中测量了大鼠的空腹血糖（FBG）、体重以及食物和水的摄入量。如图3所示，MLs显著降低了T2D大鼠的FBG，改善了T2D大鼠过度饮水的症状。此外，ML组大鼠的食物摄入量有减少的趋势，但无统计学差异。统计结果见补充表S2-S5。
图6 大鼠血清中差异代谢物的热图（红色和蓝色分别代表增加和减少的代谢物含量）。本研究采用PCA观察各组数据的整体变化趋势。PCA结果显示所有样本均分布在95%的置信区间内，表明PCA模型是可靠的。PCA评分显示，对照组和T2D组的样本在正负离子模式下可明显分离，提示T2D大鼠血清中代谢物水平发生明显变化，血清中生理代谢受到干扰。ML组大鼠血清代谢物与T2D组大鼠有显著差异，且与对照组相比有恢复趋势，提示MLs调节代谢过程并改善T2D大鼠的代谢紊乱（图4）。然后，我们使用有监督的OPLS-DA模型对每组进行配对比较（图5）。我们汇总所有鉴定的差异代谢物，以确定T2D组和对照组以及ML组和T2D组大鼠血清中代谢物的差异（VIP >1，倍数变化>1.2，p值 < 0.05），并寻找代谢水平被ML逆转的代谢物。最后，我们在血清中获得了88种内源性差异代谢物，其中62种上调，26种下调（表S6）。
图7 （A）T2D相较对照以及（B）ML对比T2D大鼠血清中差异代谢途径分析的气泡图。我们对大鼠血清中的潜在差异代谢物进行热图分析。结果显示，对照组和T2D大鼠血清中代谢物水平存在显著差异，ML组水平趋于恢复至对照组，表明MLs可以纠正T2D大鼠血清代谢物的异常水平，如图6所示。我们对大鼠血清中发生显著变化的代谢物进行通路富集，如图7所示。图中每个圆圈代表不同的代谢途径，圆圈颜色代表-log（p值），也沿纵轴表示。横轴代表富集因子；富集因子越大，该途径中差异代谢物的富集水平越高。图右上方的通路是显著影响的差异通路。
图8 ML处理T2D大鼠血清中的潜在代谢物变化。（A）丙酮酸、（B）L-缬氨酸、（C）L-酪氨酸、（D）顺乌头酸、（E）L-苏氨酸、（F）瓜氨酸、（G）4-咪唑酮-5-丙酸、（H）L-赖氨酸、（I）L-组氨酸、（J）5-羟基吲哚乙醛、（K）肌酸、（L）L-脯氨酸（##p < 0.01与对照组相比。**p < 0.01与T2D组相比。ML：（4 g/kg））。结果表明，在用MLs处理后，T2D大鼠中瓜氨酸、肌酸、L-组氨酸、丙酮酸、顺乌头酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-苏氨酸和L-缬氨酸的水平显著下调，并且血清中的L-组氨酸、4-咪唑酮-5-丙酸酯、氨基甲酰磷酸、N-乙酰鸟氨酸、L-脯氨酸、5-羟色胺、5-羟基吲哚乙醛、肌酸和 L-赖氨酸含量上调（图8）。代谢产物主要参与氨基酸代谢、糖脂代谢等途径，提示MLs可能通过调节氨基酸代谢、糖脂代谢等途径发挥降糖作用。我们对参与桑叶调控的氨基酸代谢途径以及糖脂代谢途径进行了功能分析，并绘制了桑叶低血糖的网络机制，如图9所示。在用MLs处理后，大多数异常的脂质代谢物在T2D大鼠中被恢复到正常水平，表明MLs可以调节大鼠的多种脂质代谢途径并改善IR和T2D症状。
图9 MLs改善T2D的网络机制。实线为一步反应，虚线为多步反应。红色和蓝色表示T2D大鼠血清中含量显著增加和减少的差异代谢物。“↑”和“↓”分别代表ML治疗后T2D大鼠血清中差异代谢物的增加和减少。T2D发病率逐年上升，其特点是病程长、易发生糖尿病并发症，给社会和家庭带来沉重负担。T2D是一种以血糖升高为特征的高危代谢疾病，涉及全身糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢紊乱。中医药治疗T2D经验丰富；中药多成分、多靶点的特点，可以针对T2D的复杂发病机制，在T2D的治疗中具有独特的优势。同时，中药的化学成分多样，是探索降糖药物和新药开发的宝库。MLs是桑树的干燥老叶，对2型糖尿病的治疗非常有效，但其具体化学成分和降血糖机制尚不清楚。本文采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS对ML提取物进行检测，共鉴定出61种化合物，包括16种黄酮类化合物、21种有机酸、9种酚类化合物、3种生物碱、3种香豆素和9种其他类别（图1，表S1）。研究报告了其中几种化学成分在调节糖脂代谢和抗氧化活性方面的药理活性，包括具有抗氧化作用的异槲皮苷（类黄酮）、原儿茶酸和咖啡酸（酚酸），以及能抑制脂肪形成和调节脂质代谢的金丝桃苷和芦丁。同时，我们评估了ML提取物对T2D大鼠的降血糖作用；结果表明，ML提取物可以显著降低FBG并改善T2D大鼠的糖尿病症状（图3）。血清中富含小分子代谢物，能充分反映疾病的发生情况以及药物对机体的调节作用。在本研究中，UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS结合多变量统计分析，被用于检测和分析血清中代谢物的变化。PCA结果显示ML组大鼠血清代谢产物与T2D组大鼠有显著差异，并趋于恢复至对照组，提示MLs参与调节代谢过程和改善T2D大鼠的代谢紊乱。最后，我们在血清中发现了88种差异代谢物。如图8、9 所示，关键代谢物，如丙酮酸和顺乌头，在T2D大鼠中显著上调，表明T2D大鼠的糖酵解和TCA循环均异常上调，并且身体加速了膳食糖摄入的吸收。相反，在用MLs处理后，T2D大鼠的丙酮酸和顺乌头显著下调。因此，结果提示MLs可能通过抑制T2D大鼠的糖酵解和TCA循环，减少能量的摄入和吸收，降低血糖，改善T2D的症状。结合差异代谢物途径富集的结果和参考文献，结果表明，ML提取物通过调节组氨酸合成和降解，缓解氧化应激，改善慢性炎症，缓解T2D症状，增加了体内组氨酸的含量。ML提取物通过调节支链氨基酸代谢和调节mTOR和AMPK信号通路来增加胰岛素敏感性，从而减少BCAA合成并增加脂肪动员以及BAT产热以改善T2D症状。MLs可通过上调血清色氨酸含量，改善氧化应激水平和炎症反应，调节机体免疫状态，调节糖异生降低血糖，有效治疗T2D，MLs可能通过调节体内赖氨酸水平达到治疗T2D的目的。实验结果表明，T2D大鼠血清中各种脂质代谢物显著上调，如甘油磷酸胆碱、植物鞘氨醇和磷酸二羟丙酮。脂质代谢异常有利于T2D的发展。脂质代谢紊乱会影响胰腺β细胞的功能，进而引起或加重IR，而IR和胰岛素分泌不足会进一步加重脂代谢紊乱，形成恶性循环，导致IR和胰岛素分泌紊乱以及脂代谢紊乱逐渐加重。MLs处理后，大多数异常脂质代谢物在T2D大鼠中被纠正至正常水平，表明MLs可以调节大鼠的多种脂质代谢途径并改善IR和T2D症状。总之，MLs提取物含有多种化学成分，能够显著降低T2D大鼠的空腹血糖。ML提取物可调节体内多种代谢途径，如碳水化合物、氨基酸和脂质代谢，调节机体免疫状态，减少体内氧化应激和炎症，调节糖异生，提高脂肪动员效率和BAT产热，达到降糖改善T2D症状的效果。本文采用LC-MS对MLs的化学成分进行分析，共鉴定出61种化合物，包括黄酮类、有机酸类、酚类化合物、生物碱类和香豆素类等。功效评价结果表明，ML提取物可显著降低T2D大鼠空腹血糖，改善糖尿病其他症状。血清代谢组学结果可以得出结论，ML提取物通过调节脂质代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢，调节免疫状态，减少氧化应激和炎症，调节糖代谢，并增加脂肪动员以及BAT产热，从而改善T2D症状。
|
