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编译：秦时明月，编辑：谢衣、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 代谢综合征是一种复杂的代谢紊乱症候群，包括肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗和肝脂肪变性，是威胁人类健康的危险因素。该研究以陈皮多甲氧基黄酮提取物（PMFE）为研究对象，首先利用细胞模型、动物模型对PMFE改善脂代谢紊乱活性进行评价，结果表明PMFE在体外可通过mTOR/p70s6k通路抑制SREBP活性发挥降脂功效，在体内可剂量依赖性地抑制高脂小鼠的体重增长，减轻脂肪堆积，有效降低血脂水平，改善胰岛素抵抗与葡萄糖耐受，且无明显毒性。该研究进一步从肠道微生态学和代谢组学角度系统研究了PMFE改善代谢综合征的整合作用机制，结果表明PMFE可调节肠道菌群的整体结构，重建具有正常功能的肠道微生态系统，并且在整体上对高脂造成的宿主代谢紊乱发挥纠偏作用，主要回调支链氨基酸及芳香族氨基酸水平；抗生素抑制和粪便移植试验发现，肠道菌群是PMFE改善代谢综合征的重要“靶器官”，PMFE可显著富集拟杆菌属细菌B. ovatus。研究首次发现B. ovatus为一株能显著降低高脂小鼠的体重，减少脂肪堆积，改善血脂和胰岛素抵抗的有益菌，是PMFE抗代谢综合征的重要靶点。 论文ID 原名：Citrus polymethoxyflavones attenuate metabolic syndrome by regulating gut microbiome and amino acid metabolism 译名：陈皮多甲氧基黄酮可通过调节肠道微生态系统和氨基酸代谢来减轻代谢综合征 期刊：Science Advances IF：12.804 发表时间：2020.01 通讯作者：李萍，李菁，刘鄂湖 作者单位：中国药科大学 实验设计 本研究试验过程中使用的所有PMFE都是通过相同的标准化工艺制备的。研究人员首先进行了细胞试验，所用材料为HL-7702细胞并在添加青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和10%(v/v)胎牛血清的改良Eagle’s培养基中培养，然后对处理或对照的细胞进行荧光素酶检测与Western blot分析。动物试验材料为8周龄的C57BL/6J雄性小鼠。将小鼠随机分成两组，分别饲喂标准饲料或者高脂饲料(HFD)，外加每日灌胃0.5%羧甲基纤维素钠(CMCNa)或PMFE(30、60或120 mg/kg)。然后，收集处理与对照小鼠的血清和粪便样品，使用超高效液相色谱-质谱联用法来进行代谢组学研究。研究人员测定了小鼠血清中六种靶向氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和丝氨酸)的含量。随后进行抗生素处理与粪便微生态系统移植，以及B. ovatus对小鼠的干预研究，并进行了粪便样本的16S rDNA扩增序列测定，然后对粪便进行体外的分批培养发酵、粪便DNA提取及Bacteroides菌属丰度的定量研究以测定粪便中B. ovatus的数量。 实验结果 1 陈皮多甲氧基黄酮通过抑制mTOR/p70S6K/SREBP途径进行代谢保护作用 2 陈皮多甲氧基黄酮在HFD喂养的小鼠中表现出显著的代谢保护作用 为了探究陈皮PMFE是否表现出代谢保护作用，研究人员使用HFD喂养的小鼠作为代谢综合征模型。在HFD喂养的小鼠中，8周PMFE处理的小鼠显著降低了体重增加(图2A)。在饲喂HFD的各组之间没有观察到显著的食物摄入量差异，这表明PMFE的影响不是由于食物消耗的减少而产生的(图2B)。PMFE处理也减少了脂肪沉积、肝脏组织中的脂质积累以及白色和棕色脂肪细胞组织的大小(图2C-G)。同时，PMFE处理的HFD喂养小鼠的葡萄糖耐量和胰岛素抵抗明显改善(图2F-H)。PMFE处理的小鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量显著降低，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量没有明显升高(图2I)。PMFE对HFD诱导的肝损伤也有保护作用，这与血浆ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)水平显著降低有关。研究人员进一步评估了PMFE对炎性细胞因子和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的影响。结果表明，PMFE显著降低了分泌型肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-1β (IL-1β)和IL-6在血清中的含量，及其在肝组织中的表达。此外，PMFE处理小鼠的巨噬细胞水平和MCP-1的表达降低。免疫组化结果显示，PMFE可抑制mTOR和p70S6K的磷酸化，降低SREBP-1/2的表达，与体外试验结果一致。研究人员发现，PMFE能够以剂量依赖的方式，有效地改善小鼠由于长期高热量饮食诱导的肥胖、肝脏脂肪变性、血脂异常和胰岛素抵抗。高剂量PMFE的代谢保护作用几乎与洛伐他汀相当，甚至更好，而PMFE在正常喂食的小鼠中没有产生任何明显的作用。这些结果表明，PMFE在HDF喂养的小鼠中表现出显著的抗代谢综合征效果。
图2 陈皮PMFE在高脂饲料喂养的小鼠中表现出显著的代谢保护作用。(A)每天用溶剂(0.5%CMCNa)、PMFE或洛伐他汀处理喂食正常食物和HDF的小鼠的体重，为期8周。(B)上述四组小鼠的平均每日进食量。(C)附睾脂肪。(D)肝脏重量。(E)用油红O脂肪染色法测定的肝脏脂质含量。(F)PMFE对胰岛素耐量试验(ITT)中初始血糖水平百分比的影响。(G)苏木精伊红(H&E)染色的白色脂肪组织的代表性图片。(H)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)测定PMFE对糖耐量的影响。(I)血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。 3 陈皮多甲氧基黄酮减轻了HFD诱导的肠道微生态失调 该研究通过对小鼠粪便中细菌16S rDNA进行焦磷酸测序分析，研究了PMFE对肠道微生态系统的影响。研究人员使用基于UniFrac的主坐标分析(PCoA)观察到了对照组、HFD和PMFE处理组的微生态系统组成的明显聚类(图3A)。为了评估不同类群中细菌群落的总体组成，研究人员在门的水平上分析了细菌分类的相似程度。与正常喂食的小鼠相比，HFD喂食的小鼠显示出较高的Firmicutes相对丰度和较高的Firmicutes与Bacteroidetes比率，而PMFE处理在很大程度上阻止了这种影响(图3B-C)。同时，HFD小鼠表现出了上皮破裂和脓肿，以及水肿的增加和粘膜下层的细胞浸润，这些症状在PMFE处理后显著改善(图3D)。HFD还可能影响上皮的完整性，从而导致肠道通透性受损，并导致脂多糖释放到循环中。PMFE处理增加了紧密连接蛋白ZO-1和封闭蛋白的表达，这表明了PMFE在调节肠道通透性方面的潜在作用。总之，PMFE给药对HFD喂食导致的肠道微生态系统的重塑有显著影响。 在HFD喂食的小鼠补充了PMFE后，其显著增加了87个操作分类单元(OTU)，并以剂量依赖的方式降低了50个OTU。这些变化的OTU大多属于Bacteroidetes S24-7 (34个OTU)、Firmicutes Ruminococcaceae (26个OTU)、Firmicutes Lachnospiraceae (11个OTU)和Bacteroidetes Bacteroidaceae (10个OTU)。在这137个OTU中，PMFE处理调节了50个OTU，与正常喂食的小鼠相比，HFD喂食后这些OTU发生了改变(图3E)。值得注意的是，8个OTU来自Bacteroidetes。此外，PMFE还能减少条件性致病菌的种类，如Firmicutes Paraprevotella和Firmicutes Streptococcus。这些结果表明，PMFE调节了HFD小鼠的肠道微生态系统，使其类似于正常喂食小鼠的微生态系统组成。 4 陈皮多甲氧基黄酮改变了HFD小鼠代谢综合征相关的支链氨基酸水平 肠道微生态系统对宿主的影响与一系列宿主-微生物代谢组成的复杂的相互作用密切相关。为了评估PMFE重塑小鼠肠道微生态系统后的代谢变化，研究人员对小鼠血清和粪便样品进行了非靶向代谢组分析，在粪便中共检测到1769个阳离子和663个阴离子。通过主成分分析模型发现，正常喂食、HFD喂食和PMFE处理之间的代谢物有明显的聚集性(图4A)。正交偏最小二乘法辨别分析(O-PLS-DA)也显示出这些组的明显分离。饲喂HFD足以引发代谢物的广泛变化，与正常喂食的小鼠相比，分别有68种和23种代谢物被显著诱导和抑制。值得注意的是，PMFE处理调节了饲喂HFD时改变的代谢物，消除了24个HFD诱导的代谢物的改变 (图4B)。通过MetaboAnalyst生成的拓扑图显示了PMFE对这些代谢物的影响，并揭示了受缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成影响最显著的途径(图4C)。在血清中，研究人员也发现PMFE处理导致了类似的变化趋势。通过不同组的交叉比较，共鉴定出73种(正常与HFD)和48种(HFD与PMFE)差异代谢物。另外，PMFE处理调节了13种差异代谢物(7种上调，6种下调)。另外，研究人员用气相色谱-质谱分析(GC-MS)对不同组别的粪便和血清样本中的氨基酸水平进行了靶向代谢组学分析。HFD组的粪便和血清与正常喂养的小鼠相比，缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸水平显著升高，而在正常喂养的小鼠中，PMFE处理则以相同的方向改变了它们的水平(图4D)。Spearman’s相关分析表明，这些氨基酸水平与代谢特征呈正相关，包括体重增加、血脂和胰岛素抵抗(图4E)。 图4 陈皮PMFE改变了HFD小鼠代谢综合征相关的支链氨基酸水平。 (A) 对照组、HFD和PMFE组粪便代谢物的主成分分析(PCA)。(B)与PMFE处理的小鼠相比，喂食HFD改变的差异代谢物的热图。(C)对照组与HFD组和HFD组与PMFE组的紊乱的代谢途径。(D)利用GC-MS比较粪便中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和苯丙氨酸的循环水平。(E)粪便中氨基酸与代谢综合征相关指标的Spearman’s相关性热图分析。 5 陈皮多甲氧基黄酮以依赖肠道微生态系统方式减轻HFD小鼠体内的代谢综合征 为了研究PMFE的代谢保护作用是否依赖于肠道微生态系统，研究人员用包括万古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑和氨苄青霉素在内的多种抗生素对PMFE喂养的HFD小鼠进行处理。与对代谢紊乱的影响一致，PMFE可显著降低体重增加、脂肪沉积和血脂异常。但当抗生素鸡尾酒抑制肠道微生态系统时，PMFE的代谢保护作用消失。在抗生素组和抗生素+PMFE组之间，体重增加水平、总TC、TG、LDL和HDL水平以及胰岛素敏感性没有显著差异，表明PMFE是以肠道微生态系统依赖的方式减弱了饮食诱导的代谢综合征。与血清和粪便氨基酸的靶向代谢组学图谱结果一致，通过PMFE处理的氨基酸浓度的降低被抗生素干预所阻止。这些结果表明，PMFE以肠道微生态系统依赖的方式保护小鼠免受饮食诱导的代谢综合征，并进一步影响循环中的氨基酸浓度。 6 陈皮多甲氧基黄酮的代谢保护作用可通过粪便移植转移 为了进一步研究由肠道微生态系统介导的PMFE的有益作用及其对宿主氨基酸代谢的影响，研究人员将PMFE处理的小鼠(HFD喂养)的肠道菌群转移到只喂饲HFD的小鼠体内，随后检查了代谢综合征相关性状(图5A)。在处理8周后，与只喂饲HFD的小鼠相比，接受了PMFE处理的小鼠表现出明显的体重降低(图5B)。粪便移植处理显示出了与PMFE处理组相似的代谢保护作用。这些小鼠已经表现出的肝脏脂肪变性、糖尿病症状、体重和附睾脂肪的代谢综合征特征得到了改善；但是，胰岛素敏感性并没有得到很大的改善(图5C-F)。相反，只喂饲HFD的小鼠没有改善代谢综合征相关性状。另外，研究人员还在接受了粪便移植处理的小鼠中检测到了包括支链氨基酸、苯丙氨酸和丝氨酸在内的粪便中氨基酸丰度的降低，这与PMFE处理的小鼠的结果相似(图5G)。为了证实粪便移植对肠道微生态系统的调节，研究人员进行了16S rDNA测序来检测肠道细菌的组成。PCoA显示，PMFE和PMFE→HFD处理组之间的微生物群落显示出更高的相似性(在HFD和HFD→HFD组中也观察到了类似的趋势)。PMFE处理组的粪便移植显示出Firmicutes与Bacteroidetes的比率显著降低。热图显示出PMFE和PMFE→HFD组之间有很大的重叠。来自PMFE处理小鼠的粪便移植改变了OTUs，特别是对于减少的分类单位，这与直接用PMFE处理的结果相同。 图5 陈皮多甲氧基黄酮的代谢保护作用可通过粪便移植转移。(A)粪便移植试验的设计。(B)四组小鼠的体重。(C)附睾脂肪。(D)肝脏重量。(E)ITT测定的胰岛素耐量。(F)血液中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。(G)用气相色谱-质谱法测定的粪便中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸的相对丰度。 7 陈皮多甲氧基黄酮介导的B. ovatus的富集作用改善HFD小鼠体内代谢综合征 肠道微生态系统、氨基酸代谢的改变和PMFE的代谢保护之间的关系已经在之前的试验中得到了全面的研究。Bacteroides菌属被鉴定为响应PMFE处理的关键属，如图3E所示。为了直接评估PMFE对Bacteroides菌属的影响，在厌氧条件下，通过体外粪便分批培养发酵，测定了10株Bacteroides在PMFE处理后的丰度(图6A)。发酵24小时后，通过qPCR试验测定，研究人员发现PMFE能显著富集B. ovatus、B. thetaiotaomicron、B. vulgatus、B. dorei、B. caccae、B. stercoris以及B. uniformis，并降低B. fragilis、B. finegoldii 与B. coprophilus的丰度 (图6B)。此外，研究人员利用GC-MS代谢组学方法对发酵过程中0、12、24、48h厌氧条件下的氨基酸浓度进行了检测。结果表明，PMFE能显著降低体外分批培养中的氨基酸水平(图6C)。 由于PMFE处理后，B. ovatus数量的增加在Bacteroides菌属中最为显著，因此该研究接下来分析了B. ovatus与代谢综合征之间可能的因果关系。HFD小鼠每天用B. ovatus菌株灌胃，处理8周后检测代谢综合征相关性状。在粪便DNA中，观察到用B. ovatus处理的HFD小鼠在粪便DNA中的定植。同时，PMFE处理也极大地丰富了B. ovatus的数量(图6D)。研究发现，用活体而不是灭活的B. ovatus灌胃，显著降低了HFD小鼠的体重增加和脂肪积累(图6E)。与用灭活的B. ovatus灌胃的HFD小鼠相比，施用活性的B. ovatus大大降低了血清中低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯的浓度(图6F)。活性B. ovatus处理也显著改善了血清中丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶含量。然而，研究人员没有观察到在B. ovatus灌胃后，糖耐量和胰岛素抵抗有明显的改善。值得注意的是，与用灭活的B. ovatus灌胃的HFD小鼠相比，用活性B. ovatus灌胃的HFD小鼠的粪便中，支链氨基酸丰度要低得多(图6G)，而在血清样本中也测量到了类似的结果。综上所述，这些发现表明，PMFE处理可以富集共生细菌B. ovatus，这种细菌可以减轻饮食诱导的肥胖和代谢紊乱，并调节循环中的氨基酸浓度。 图6 陈皮PMFE介导的B. ovatus的富集可降低HFD小鼠的代谢综合征水平。(A)体外分批培养发酵和体内验证的试验设计。(B)PMFE处理后Bacteroides的相对丰度。(C)不同浓度PMFE处理0、12、24、48h后氨基酸浓度的变化。(D)用qPCR方法测量B. ovatus的相对丰度。(E)四组小鼠的体重。(F)血液中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平。(G)用气相色谱-质谱法测定的粪便中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的相对丰度。 讨论 本研究结果表明，陈皮PMFE可能通过调节肠道微生态系统来调节氨基酸代谢，从而抑制代谢综合征。施用PMFE改善了代谢功能障碍，包括富集有益的肠道细菌B. ovatus。本研究的发现对理解微生物菌群与植物化学相互作用的一种新的机制具有重要的参考价值。 评论 原文网址：https://advances./content/6/1/eaax6208
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