 前 言 采用肠道微生物体模拟批式发酵的方法，探究人体肠道微生物对氨基酸代谢特征及其代谢产物对上皮细胞通透性的影响。选取 27 位年龄在20~55岁健康人的粪便样本， 利用常见的 20 种氨基酸并对照小牛血清蛋白、NaCl 培养 基，进行 24 h 体外批次发酵，采用气相色谱检测发酵液中短链脂肪酸的含量。然后，测定氨基酸的短链脂肪酸对 Caco-2 细 胞的跨膜电阻值（TEER）的影响。检测结果表明在含亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）的培养基中，异戊酸产量明显高于对照组 （P<0.01）；在含缬氨酸（Val）的培养基中，异丁酸水平显著升高（P<0.01）；在含脯氨酸（Pro）的培养基中，戊酸产量明显增加 （P<0.01）。Caco-2 细胞试验表明：戊酸能显著提高 Caco-2 细胞跨膜电阻值（P<0.01），而异丁酸和异戊酸能显著降低细胞跨 膜电阻值。因此，本试验揭示结肠内容物中的异戊酸是由 Leu、Ile 降解形成；异丁酸是由 Val 代谢形成；戊酸主要是由 Pro 代谢产生，并且能够显著增强肠道黏膜屏障功能。 摘 要 人类胃、肠道内存在大量的细菌，主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）等组成，其总数达到1012~1013CFU/g内容物[1-2]。大量研究表明与消化、精神、免疫、内分泌系统相关的多种疾病和肠道菌群失调有关[3-5]，因此，调控肠道菌群对预防慢性病发生具有重大意义。环境因素特别是饮食模式是调节肠道菌群的关键因素。在正常饮食模式下，每天大约有20g膳食纤维和2~10g蛋白质能够逃逸小肠吸收进入结肠，成为结肠中细菌发酵的底物[6]。而细菌发酵食糜后的最主要代谢产物为短链脂肪酸（Shortchainfatacid，SCFA），包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和异丁酸[7]。其中乙酸、丙酸、丁酸是肠道细菌发酵碳水化合物的代谢产物[8]。   01 材料与方法   1.1 试验试剂与仪器 试验中使用的20种氨基酸，包括Val、Leu、异亮氨酸（Isoleucine，Ile）、脯氨酸（Proline，Pro）、丙氨酸（Alanine，Ala）、甲硫氨酸（Methionine，Met）、甘氨酸（Glycine，Gly）、苏氨酸（Threonine，Thr）、组氨酸（Histidine，His）、天冬氨酸（Aspartate，Asp）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、谷氨酸（Glutamicacid，Glu）、赖氨酸（Lysine，Lys）、谷氨酰胺（Glutamine，Gln）、天冬酰胺（Asparagine，Asn）、色氨酸（Tryptophan，Trp）、苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、精氨酸（Arginine，Arg）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）、丝氨酸（Serine，Ser）均为色谱纯级，美国Sigma公司；4种SCFA：丁酸、戊酸、异戊酸、异丁酸均为色谱纯级，美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液，生工生物股份有限公司；人结肠腺癌细胞（Caco-2），中科院上海生命科学研究院细胞库；0.25%胰酶-EDTA消化液、青霉素-链霉素混合液，美国Gibco公司；DMEM培养基、PBS缓冲液、HBSS缓冲液，美国HyClone公司；细胞培养瓶、96孔板、Transwell培养板，美国Corning公司；胎牛血清（FBS），以色列BiologicalIndustries公司。高压蒸汽灭菌锅，上海博迅医疗生物仪器有限公司；分析天平，瑞士MettlerToledo公司；厌氧工作站，英国依莱泰科；GC2010plus气相色谱仪，日本岛津公司；DB-FFAP型气相色谱柱（0.32mm×30m×0.5μm），美国Agilent公司；MX-307高速离心机，日本TOMY公司；超纯水仪、细胞电阻仪，美国Millipore公司。 1.2 试验方法 L8900氨基酸自动分析仪，日本日立公司；色谱柱为磺酸型阳离子树脂柱，检测波长570nm和440nm；THU-35C砻谷机，日本佐竹制作所；JNM-Ⅲ型碾米机，成都施特威科技发展公司；101型烘箱，上海索谱仪器有限公司；ME204E电子天平，梅特勒－托利多公司。 1.2.1 粪便样品采集与预处理 27例健康志愿者来自浙江省农业科学院，男16人，女11人，年龄在20~55岁。所有志愿者有近3个月的正常饮食，在这3个月内没有服用抗生素或其它药物，也没有接受过益生菌治疗。研究人员向受试者进行全面解释，并给予受试者书面知情同意。收集志愿者的粪便样本均在6h内处理结束。取3g粪便样本装入取样管中，加入30mL厌氧磷酸缓冲液（PBS）配制成体积分数10%的粪便悬液。用涡旋震荡器（Vortex）充分振荡使其混匀后，再用粪便处理器过滤除去粪便中未消化的大颗粒食物残渣。 1.2.2 培养基的配制 20种溶于水的培养基配制方法：100mgVal、Leu、Ile、Pro、Ala、Met、Gly、Thr、His、Asp、Tyr、Glu、Lys、Gln、Asn、Trp、Phe、Arg、Cys、Ser分别溶解于10mL超纯水中，配制成10g/L的氨基酸培养基，500mg小牛血清蛋白BSA、NaCl分别溶于10mL超纯水中，配制成50g/L的对照组溶液；2种微溶于水的氨基酸（Tyr、Asp）培养基配制方法：5mgAsp溶于1mL超纯水中，配制成5mg/mLAsp培养基；1.25mgTyr溶于5mLPBS溶液中，配制0.25mg/mLTyr培养基。1.2.3体外发酵参照Zarling等[10]报道的体外发酵方法，使用前期报道过的批式发酵系统[18]。在厌氧工作站中，将灭菌的10mL西林瓶身上贴好22种培养基标签。20种溶于水的培养基发酵方法：将100μL溶于水的20种培养基分装到对应培养基标签的西林瓶中，接种3mL10%的粪便悬液，压盖。2种微溶于水的培养基发酵方法：将200μLAsp培养基分装到对应培养基标签的西林瓶中，接种3mL10%的粪便悬液，压盖；称量0.5g粪便，加入5mL0.25mg/mLTyr培养基，混匀并过滤，配制成10%Tyr/PBS粪便悬浊液，取3mL分装到对应培养基标签的西林瓶中，压盖。所有西林瓶放置在37℃恒温培养箱中培养24h，在24h取样。 1.3 SCFA 分析 气相色谱检测24h样品中SCFA的浓度。试验中，500μL发酵液样品加入100μL巴豆酸，酸化24h，离心后取上清，经过0.22μm水系过滤膜，上机。过滤液通过DB-FFAP型气相色谱柱（0.32mm×30m×0.5μm），使用氢气火焰离子化检测器，以巴豆酸（反式-2-丁烯酸）作为内标物，检测乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸。 1.4 细胞培养 将Caco-2细胞接种于培养瓶，培养液为DMEM高糖（4.5g/L）培养基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酰胺、青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL），置于5%CO2、37℃培养箱，每隔3~4d传代1次，取对数生长期细胞作后续试验。将状态良好的细胞消化，吹打均匀，调节密度2×106个/mL，每孔加入2×105个细胞，同时在顶侧（Apical，AP）与基底侧（Basolateral，BL）加入不同SCFA（丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸）共同孵育72h，顶侧与基底侧的SCFA终浓度为2.5mmol/L。在孵育过程中的24，48，72h，测定不同SCFA（异丁酸、异戊酸、戊酸、丁酸）对Caco-2细胞的跨膜电阻值（TEER）的影响。 1.5 统计分析 试验数据通过SPSS软件（IBMSPSSStatistics19.0软件）先做方差齐性检验，判断数据是否符合正态分布。对不符合正态分布的数据（即方差不齐性）采用Mann-WhitneyU检验；对符合正态分布的数据（即方差齐性）选择ANOVA-LSD检验。计算得出不同氨基酸培养基与对照组的SCFA浓度的显著性差异。T值采用双总T检验中的独立样本检验计算，P<0.05表示差异有统计学差异。 02 结果与分析 2.1 人体粪便 SCFA 的组成 采用气相色谱测定27名试验参与者粪便中SCFA浓度结果见表1。  2.2 人体肠道菌群发酵 20 种氨基酸后 SCFA 产量的比较 试验采用气相色谱测定24h样品上清液中SCFA浓度。通过比较不同氨基酸培养基与对照组之间SCFA的含量(图1)，研究发现在含有20种氨基酸的培养基中，乙酸、丙酸、丁酸的产量(图1a~1c)与对照组没有显著差异，提示膳食中的氨基酸可能不参与结肠内乙酸、丙酸和丁酸的代谢合成。然而，3种SCFA(异丁酸、异戊酸、戊酸）与对照组有显著差异(图1d~1f）。其中Val培养基中异丁酸含量明显高于对照组(图1d），且有极显著性差异（t=15.4089，P=1×10-6<0.01）。Leu和Ile培养基中，异戊酸含量明显高于对照组(图1e)(Leu:t=15.3183,P=1×10-6<0.01;Ile:t=16.9307,P=1×10-6<0.01；BSA：t=4.0311，P=2.651×10-4<0.01)。Pro培养基中戊酸含量明显高于对照组中的戊酸，且有极显著差异（t=12.0208，P=3×10-6<0.01）(图1f)。该结果表明，粪便中的乙酸、丙酸、丁酸不是由氨基酸降解形成；粪便中的异戊酸是由Leu、Ile降解形成；异丁酸是由Val代谢形成；戊酸是由Pro代谢产生。 2.3 SCFA 对 Caco-2 细胞肠屏障的影响 肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸对肠道细胞具有各种作用，其中一个重要的作用为增强肠道屏障[19]。本研究采用测定Caco-2细胞跨膜电阻值（TEER）来考察SCFA对肠屏障的影响，TEER越大表示通透性越差，肠屏障功能越好。结果显示，与对照组相比，氨基酸代谢产生的SCFA中，戊酸能显著提高Caco-2细胞跨膜电阻值（图3a~3b），促进Caco-2细胞肠屏障的形成，与碳水化合物产生的丁酸类似，然而在相同浓度下，戊酸增强肠道屏障的能力较弱，需发酵48h后才有效果。已有许多研究表明丁酸可以促进肠屏障的形成[13]，而戊酸对肠屏障的影响未见报道。氨基酸产生的另外2种SCFA（异丁酸、异戊酸）会降低Caco-2细胞跨膜电阻值（图3c~3d），抑制Caco-2细胞肠屏障的形成。Blakeney等[20]研究报道，异戊酸可引起结肠平滑肌松弛，从而抑制肠道屏障的形成，与本研究结果一致。  03 讨论与结论 粪便中SCFA的含量和比例是人体健康的一个重要指标，可以直接反映肠道菌群的活性和平衡。例如，在正常饮食状态下2型糖尿病患者粪便中乙酸和丁酸的含量显著低于对照组的健康人群[21]。同时粪便SCFA含量和比例还受饮食结构的影响。Giuditta等[22]发现与低热量的地中海饮食模式相比，纯素食饮食模式下粪便中乙酸和丁酸的含量下降，而异丁酸、异戊酸含量显著增加。有报道指出健康人群粪便中碳水化合物产生的乙酸、丙酸和丁酸和蛋白质代谢产生的戊酸、异戊酸和异丁酸的摩尔比值为95∶5到90∶10[23]。而本试验组健康人群粪便中此物质的摩尔比为93∶7，提示试验参与者的膳食组成正常。而且乙酸、丙酸、丁酸之间的摩尔比值为67∶15∶11，基本符合65∶20∶15的比例，进一步提示试验组人员肠道菌群代谢处于正常状态。  人体肠道微生物降解氨基酸后主要代谢产物包括氨、生物胺、H2S和3种SCFA（异丁酸、异戊酸、戊酸），其中生物胺的研究已有较多报道[24-26]，然而对这3种SCFA（异丁酸、异戊酸、戊酸）的研究相抵比较少。Shen等[27]在2010年通过体外发酵模型对比研究了不同烹调方式下牛肉、鸡肉和三文鱼对人体肠道微生态和SCFA的影响，发现新鲜三文鱼肉显著影响到丁酸和异丁酸的产生。Zarling等[10]也是通过体外发酵试验证实了异丁酸和异戊酸分别由Val和Leu降解形成。在本研究中，研究证实了氨基酸、蛋白质食物组分在人体肠道中对乙酸、丙酸和丁酸的形成影响很小，然而直接影响戊酸、异戊酸和异丁酸的形成。除了Leu之外，肠道菌群发酵Ile也可以形成异戊酸；Val代谢产生异丁酸，而Pro代谢产生戊酸。 3种SCFA（异丁酸、异戊酸、戊酸）对人体健康的影响已有部分报道。例如，流行病学的证据表明戊酸和丁酸一样对肠道健康有益[28-29]。还有研究发现与克罗恩病患者相比，健康人的粪便中含有更多产戊酸的细菌[29]。对老年人的研究发现，健康百岁老人的粪便中戊酸、丙酸与丁酸的浓度明显升高[30]。Blakeney等[20]研究报道，异戊酸可引起结肠平滑肌松弛，从而抑制肠道屏障的形成。Yuille等[31]报道戊酸能够像丁酸一样，在体外细胞模型中作为组蛋白去乙酰化酶的抑制剂影响细胞的繁殖周期。因此，本研究中也利用体外细胞模型，比较了氨基酸代谢产物异丁酸、戊酸和异戊酸对细胞通透性的影响。研究发现只有戊酸能够在体外增加Caco-2细胞肠屏障，而异戊酸和异丁酸降低Caco-2细胞肠屏障，并且在2.5mmol/L浓度下戊酸增强肠道屏障的能力稍弱于丁酸，丁酸增强肠道屏障已经有众多研究，其增强肠道屏障的机制主要通过激活AMPK介导紧密连接重组装实现[32]，氨基酸代谢产物戊酸增强肠道屏障为首次发现，相关研究有待进一步探索，如其强肠道屏障的具体机理等，因其化学结构与丁酸具有相似性，其机制可能也是通过激活AMPK介导紧密连接重组装而实现。戊酸对人体健康的影响逐渐受到越来越多的关注。最近有报道戊酸通过T淋巴细胞和B淋巴细胞的代谢和表观遗传重编程发挥其免疫调节作用[33]，这些表明戊酸在人体健康中可能起正向作用。同时，本研究发现异丁酸、异戊酸能够增加肠道通透性，在人体健康中可能起到反向作用。国外研究报道中已经发现粪便中异戊酸含量高与人体抑郁症的发病有关[34]，结合本研究结果，提示异戊酸可能影响到肠粘膜的通透性，进而通过脑肠轴影响到与精神系统有关疾病的发生。本研究中这些对人体健康起不同作用的戊酸、异戊酸、异丁酸，在肠道菌中由特定的氨基酸发酵降解而成，因此高蛋白饮食经肠道菌发酵后对人体健康的不同影响可能与其含不同的这些特定氨基酸有关。 总之，本研究利用体外发酵模型，探究了氨基酸作为底物对肠道微生物代谢产物 SCFA 产生的影响，填补了多年来在 3 种 SCFA（异丁酸、异戊酸、戊酸）底物研究上的空缺。同时采用测定细胞跨膜电阻值的方法， 比较了对人体上皮细胞通透性的影响。目前的研究虽然都采用体外模型，但是研究结果为今后进一步探究肠道菌群氨基酸代谢对机体健康状态的影响奠定了基础。 参考文献 [1] 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