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复杂肠道微生物组的设计、构建和体内强化 Design, construction, and in vivo augmentation of a complex gut microbiome  Resource, 2022-09-15, Cell, [IF 64.5] DOI：10.1016/j.cell.2022.08.003 原文链接：https://www./science/article/pii/S0092867422009904 第一作者：Alice G. Cheng 通讯作者：Alice G. Cheng, Kerwyn Casey Huang, Michael A. Fischbach 主要单位： 斯坦福大学医学院胃肠病学和肝病科 斯坦福大学生物工程系 旧金山Chan Zuckerberg生物中心 斯坦福大学ChEM-H研究所 斯坦福大学医学院微生物学和免疫学系 劳伦斯伯克利国家实验室，环境基因组学和系统生物学部 加州大学伯克利分校植物与微生物生物学系 - 亮点 -
- 摘要 - 在小鼠中模拟人类肠道微生物组的研究揭示了宿主-微生物相互作用机制。然而，迄今为止所研究的菌群模型只具备“明确”或“复杂”一个特征，这限制了它们的实用性。在这里，作者在体外构建并表征了由104种细菌组成的确定菌群（hCom1），这些细菌由人类肠道微生物组中最常见的分类群组成。然后，使用了一个迭代的实验过程来填充开放的生态位：用hCom1定殖无菌小鼠，然后用人类粪便样本移植。作者发现了在粪便处理后定殖的新物种，并将它们添加到hCom1中，作为hCom2。在无菌小鼠中，hCom2对粪便的移植表现出更高的稳定性和对致病性大肠杆菌的强大定殖抗性。hCom2定殖小鼠与人类粪便菌群定殖小鼠表型相似，表明该菌群将为研究微生物组中相关表型与物种、基因之间的机制成为可能。  图形摘要 - 引言 - 将微生物组移植到无菌小鼠体内的实验为研究微生物组的机制和因果关系打开了大门。这些研究根据移植菌群的性质分为两类：完整的、不确定的菌群（即粪便样本）和不完整但确定的菌群（即合成菌群）。粪便移植研究表明，微生物组在多种宿主表型中发挥作用，包括对癌症免疫治疗的反应，热量获取，对肠道病原体的定殖抗性和神经发育。尽管这些研究具有启发性，但这种研究模式的一个局限性是难以对菌群中的微生物进行“分馏（fractionate）”，这使得发现哪些物种参与感兴趣的表型具有挑战性。 作为肠道微生物组的模型系统，合成菌群发展得不太好。开创性的研究表明，一个合成菌群可以模拟饮食对微生物组的影响，在15个成员的菌群存在的情况下，确定了拟杆菌在小鼠肠道中生长所需的基因，并证明了由单一供体分离的物种组成复杂的菌群可以稳定地定殖在小鼠体内。最近的研究揭示了免疫调节、多糖消耗和其他由微生物组驱动的复杂表型的机制。尽管合成菌群能够被精确控制和操作，如菌株去除和基因敲除，但所使用的菌群通常复杂性较低（20株），限制了它们模拟原生微生物组生物学的能力。 一个理想的肠道微生物组模型系统可以捕捉到这两种方法的优点：接近原生的复杂性将使模型微生物组能捕捉到生态系统中简单模型系统缺少的特性，包括涌现特征如对扰动的恢复能力和合作代谢等。此外，复杂合成菌群是肠道微生物组体内研究的一个有希望的起点，因为它们更适合于模拟菌群水平的现象，如免疫调节和多物种生物膜的形成。 完全明确的菌群（即完全由已知生物组成的菌群）将使还原论实验能够探索机制。构建具有确定组成的菌群的能力在实验测试是否可以通过粪便移植将表型转移到无菌小鼠的背景下尤为重要。目前，由于移植菌群通常是不确定的，因此很难揭示这些现象背后的机制。一个足够复杂的模型系统将使还原论的后续实验成为可能，使肠道微生物组与其他模型系统保持一致，从而使机制研究成为可能。 因此，作者试图创建一个明确的、能够精确操作的、足够复杂的菌群，以展示一个完整菌群的新特征，如移植时的稳定性和定殖抗性。作者首先构建了一个复杂的特定菌群，其中包含了人类肠道微生物组中最常见的细菌物种（hCom1）。作者证明，104个成员的菌群是可重复的，尽管存在非常低丰度的物种。通过系统地干扰该菌群及其生长介质，作者发现了构成其组成的菌株-营养物和菌株-菌株（如，共生）相互作用。然后，作者用hCom1定殖无菌小鼠，表明hCom1是稳定的，高度可重复的，并且其组成物种的相对丰度跨越了六个数量级。作者通过使用一个迭代的、基于生态的过程填充开放的生态位来强化扩充菌群，并表明强化后的菌群（hCom2）有更强的抗扰动能力和更高的对病原体定殖抵抗力。最后，证明了hCom2定殖小鼠在表型上与人类粪便移植小鼠相似，这表明合成菌群构建和强化过程为开发完整的、明确的人类肠道微生物组模型奠定了基础。 - 结果 - 1. 设计和构建一个复杂的合成菌群 Designing and building a complex synthetic community 作者着手设计一个由人类肠道微生物组中最常见的细菌物种组成的菌群。作者分析了来自美国国立卫生研究院人类微生物组计划（HMP）的宏基因组数据，以确定最普遍的微生物——存在于最大比例的受试者中的微生物，无论其丰度如何。虽然HMP不能广泛地代表来自不同地理和种族的微生物组，但该数据集非常适合作者的目的，因为它是在非常高的深度进行测序的，使作者能够识别低丰度但非常普遍的微生物。根据流行程度对细菌菌株进行排序后，作者发现在45%的HMP受试者中可稳定存在约20%（166/844）的细菌种类。在这166株菌株中，作者能通过培养收集或个人实验室获得了99株（图1A）。另外3个物种菌株没有得到，而使用了同一物种的替代菌株（Lactococcus lactis subsp. lactis Il1403, Bacteroides xylanisolvens DSM 18836和Megasphaera sp. DSM 102144）。作者引入了另外两种菌株进行下游实验：Ruminococcus bromii ATCC 27255（瘤胃球菌，多糖利用的关键物种）和Clostridium sporogenes ATCC 15579（产孢梭菌，一种具有遗传工具的模式肠道梭菌）。这104个菌株（被称为hCom1的菌群）在西方人类肠道菌群中普遍存在且数量丰富。值得注意的是，与用于模拟肠道微生物组的其他特定菌群不同，作者菌群物种数量是典型人类肠道的一半以上。  图1 一个复杂的肠道细菌菌群。 （A）基于保守单拷贝基因多序列比对的104株hCom1的系统发育树。该菌群是通过识别来自NIH人类微生物组计划（HMP）的测序数据中最流行的菌株来设计的（厚壁菌门，红色；放线菌门，蓝色；疣微菌门，橙色；拟杆菌门，绿；变形菌门，紫色）。还显示了HMP数据集中每种菌株的流行率和相对丰度（n = 81, 流行率指检测到该菌株的受试者比例），白线表示每个菌株在受试者之间的分布的log10(relative abundance)平均值。尽管在HMP样本中流行率较低，但仍将Ruminococcus bromii ATCC 27255和Clostridium sporogenes ATCC 15579加入到菌群中； （B）菌群快速达到稳定状态。在SAAC培养基上进行离体培养，检验其组成的稳定性。每个点都是一个单独的菌株；每列所有点的集合表示在该时间点的菌群组成。到12 h时，菌群中菌株的相对丰度跨越了6个数量级，并在48 h内基本保持稳定（根据菌株在48小时的丰度进行着色）； （C）在不同时间制备的两种菌群（即生物重复）在48 h时产生的菌群结构相似； （D）由相同接种物（技术重复）产生的菌群在48 h时具有几乎相同的组成。（C）和（D） 中，圆点颜色代表相应物种的门，灰色轮廓和浅色表示该菌株存在是由错误匹配。 流水线菌株生长方案简化了hCom1的组装和单菌株去除。作者发现104个菌株都可以在MM（Mega Medium）、CMM（Chopped Meat Medium）或两者中繁殖。不同菌株和培养条件下的生长速率、最大丰度和进入稳定期的时间差异很大。为了简化菌落组装过程，同时保证生长缓慢的菌种积极繁殖，将每个菌种从冷冻原液中接种到液体培养基中，每24 h传代一次，共2-3天。在混合单独培养的菌株之前，调整每种培养物的体积以达到相似的光密度。部分菌株未达到最低培稀释培养密度，直接将这些未稀释的培养物加入。使用宏基因组测序和高精度序列比对确认起始培养物是纯的，如下一节所述。 2. 高精度宏基因组序列比对流程的开发 Development of a highly accurate metagenomic read-mapping pipeline 在组装了104个物种组成的菌群后，讨论了如何准确地量化每个菌株的丰度，这是一个主要的挑战，因为作者预计一些菌株会以低丰度存在。菌群中不同菌株在V3-V4区具有相同的16S高变序列，排除了基于16S扩增子的方法。考虑设计一个定制的基于扩增子的流程，但这种方法需要在未来的菌群设计中验证新的引物集。作为替代方案，作者试图使用宏基因组测序来定量菌群组成。 为了测试现有宏基因组分析工具的性能，生成了三个基准真值（ground truth）数据集。前两个由每个菌株组装的基因组序列产生的模拟读序（reads）组成：一个是丰度相等104个菌株菌群 （以测试敏感性和特异性），另一个则是菌株丰度变化超过6个数量级的菌群（以测试动态范围）。第三组由每个菌株单独测序的实际读序组成，使用与随后的菌群分析相同的方法。这个数据集可以解释由建库和测序引入的偏差。 发现基于Bowtie2和SAMtools组合的宏基因组序列比对是敏感但不准确的：从一个菌株到另一个菌株的读序比对存在大量错误，例如来自单个菌株的全基因组测序数据经常被解释为来自多个菌株。因此，从任何丰富的菌株中读序错误比对都可能产生噪声，超过来自低丰度菌株的信号，从而降低准确性。相比之下，专注于少数通用基因或独特k-mers（如MetaPhlAn2、MIDAS、Kraken2/Bracken、IGGsearch或Sourmash）的算法通常准确到物种水平，但由于它们只使用了一小部分读序 （<1%），使它们检测低丰度或密切相关菌株的能力有限。 为了应对这些挑战，作者开发了一种新的算法，NinjaMap。利用菌群中每个菌株都已测序的事实，NinjaMap可以在六个数量级上高精度地量化菌株丰度。简而言之，NinjaMap考虑从样本中读序的每个数据。如果一个读序与群体中的任何基因组都不完全匹配（通常为3%-4%），则记录但不分配。如果一个读序只与一个菌株完全匹配，它就被明确地分配给那个菌株。如果读序与多个菌株完美匹配，则将其暂时置于托管中。在所有明确的分配完成后，计算每个菌株的相对丰度的初步估计。然后，托管的读序按照每个菌株的相对丰度按比例分配，通过可用于独特定位的基因组区域的总大小进行归一化，以避免偏向于具有较大或系统发育上不同的基因组序列的菌株，最后，计算相对丰度。 为了评估NinjaMap的性能，作者进行了两个测试。首先评估了每个菌株分类读序错误比对的程度，量化了菌株1错误分配给菌株2-104的读序数量（错误低估菌株1在菌群中的丰度），以及菌株2-104错误分配给菌株1的读序数量（错误高估菌株1的丰度）。对于模拟读序，这两种类型的读序错误比对的大多数情况共同导致相对丰度误差≤10−5。对于实际的读序，错误比对更频繁，但通常仍低于10−4的阈值（即相对丰度为0.01%）；错误比对可能是由于数据库基因组序列与作者收集的菌株的实际序列之间的偏差，或来自样品制备和测序过程。对于某些菌株来说，在菌群中错误比对对相对丰度的预期贡献甚至更低。 其次，使用NinjaMap分析了来自104个菌株菌群的模拟读序。作者发现，该工具可以准确量化丰度低至10−6的已知组成的混合菌群的菌株，与单分离样品的分析一致。因此，NinjaMap能够在广泛的相对丰度动态范围内准确地量化菌株。 3. 菌群构建是高度可重复的 Community construction is highly reproducible 首先通过在体外多次构建和培养104个成员的菌群，来测量菌群组成数据的可重复性。采用技术重复来评估细菌生长、DNA提取和测序的变化，并采用生物重复来确定接种剂制备差异的影响。繁殖48 h，并在0、12、24和48 h提取DNA进行测序。 t = 0时的细胞密度范围跨越多个数量级（图1B），所有可检测菌株的平均log10(相对丰度)为−2.5 ± 0.8。t = 0时，95/104株检出；剩下的菌株在单独培养时生长不良，低于检测极限或丰度可能由读序错误比对来解释。菌群在12小时内达到相对稳定的结构（图1B），在生物重复中具有显著的可重复性（图1C）。值得注意的是，非常低丰度的菌株（< 10−4）只比高丰度的菌株稍微多一些变化。技术上的重复甚至更加相似（图1D），表明菌群生长、DNA提取和测序对变异的贡献很小。综上所述，这些结果表明菌群组成对实验变化具有鲁棒性。 4. 营养缺失筛选绘制菌群中菌株-营养相互作用图 A nutrient dropout screen to map strain-nutrient interactions in the community 接下来，作者试图探索菌群中菌株-营养相互作用的网络。人们对肠道共生菌的多糖摄取了解很多，但对氨基酸利用的了解却很少；因此，作者在一种确定的生长培养基（标准氨基酸完全培养基[SAAC]）中进行了实验，每次可以从中去除一个氨基酸。由于氨基酸通常成对使用，从完整背景中一次删除一个而不是一次添加一个到空背景中，更有可能揭示与菌群功能相关的表型。此外，在一个多样化的菌群背景下进行这种筛选（与分析分离菌株生长的传统做法相反），可以研究菌群依赖效应，如养分竞争或相互依赖的养分利用。 为了绘制菌株与氨基酸的相互作用图，作者构建了104个成员的菌群，并用它接种20种确定的生长培养基，每种培养基缺乏一种氨基酸，以及完整的SAAC（图2A）。48 h采集样本，分析宏基因组测序数据，以确定氨基酸缺乏对每个菌株相对丰度的影响。  图2 菌株与氨基酸相互作用的系统分析。 （A）氨基酸去除实验示意图。104株的冷冻存储菌株用于培养物接种，培养24小时后稀释到（尽可能）相似的光密度并混合，将混合菌群置于不同单一氨基酸缺失的培养基中培养，以SAAC培养基为对照。48 h后，用NinjaMap对菌群进行测序和分析，以确定缺失不同氨基酸对各细菌生长的影响； （B）氨基酸缺失对菌群组成的影响。每个点都是一个单独的菌株，每一列表示该时间点的菌群组成。菌株根据其在完全培养基（SAAC）中生长的菌群中的相对丰度着色。同一样品中，相对丰度通过从更丰富的菌株中序列错误比对来解释的菌株用灰色轮廓绘制，未检测到的菌株设置为10−7以便可视化； （C）热图显示了每个菌株（x轴）在氨基酸缺失（y轴）上的分层聚类（Z score，根据除半胱氨酸缺失外所有样品中菌株丰度的标准差计算）。厚壁菌门中L. lactis，C. sporogenes和L. ruminis在缺乏亮氨酸和异亮氨酸的条件下生长较弱。那些丰度可以通过高丰度菌株的错误比对来解释的菌株没有显示出来； （D）氨基酸去除的效果因氨基酸而异。绘制了不同氨基酸缺失影响下|Z|＞2的菌株 （n = 66）。 （E）亮氨酸或精氨酸的缺乏导致C. sporogenes相对丰度的大幅下降。菌株根据其在完全培养基中生长的相对丰度着色。仅在三个样品中至少有一个样品检测到的菌株被纳入（n = 92）。C. sporogenes用黑色突出显示，L. lactis以白色突出显示。未检测到的菌株设置为10−7以便可视化； （F）C. sporogenes在完全培养基中的生长依赖于精氨酸的存在，而鸟氨酸转氨基甲酰基酶（otc）部分负责精氨酸的代谢。野生型C. sporogenes和Δotc突变体在完全培养基（添加/不添加精氨酸）中培养。生长曲线描绘了3个重复的平均值，误差条代表1个标准差； （G）C. sporogenes需要otc从精氨酸产生ATP。显示在含有2 mM精氨酸的PBS中培养的C. sporogenes的细胞内ATP水平。 （H）C. sporogenes中精氨酸代谢途径。基于这些数据，作者认为精氨酸是通过假定的精氨酸脱氨基酶CLOSPO_00894转化为瓜氨酸的；瓜氨酸随后被推测的鸟氨酸转氨基甲酰基酶CLOSPO_02415水解为鸟氨酸和氨基甲酰基磷酸，导致ATP的产生。 5. 菌株与氨基酸相互作用的全局分析 Global analysis of strain-amino acid interactions 为了确定菌株与氨基酸的相互作用，作者利用大多数氨基酸缺失对大多数菌株影响不大的事实，将各条件下相对丰度明显偏离平均值的菌株制作成表格（图2B）。当该菌群在完全确定的培养基中繁殖时，相对丰度跨越了6个数量级。36%的菌株相对丰度为10−4~10−2，8株为＞10−2，50株为＜10−4（图2B）。与模拟结果一致，NinjaMap对相对丰度低至10−6的菌株敏感，能够量化56%低于10−3检测限的菌株，通常用于宏基因组分析。因此，作者的系统能够研究低丰度的微生物，其中一些已知具有很大的生物影响。 为了确定显著的响应，作者计算了每个菌株在实验中的相对丰度的标准差，并计算了Z分数（图2C）。以前在单一培养研究中发现的菌株-氨基酸相互作用也在菌群中观察到。在缺乏甲硫氨酸的培养基中生长的菌群中Anaerostipes caccae相对丰度下降（Z = -3.48）。同样，C. sporogenes受亮氨酸缺乏（Z = -2.56）影响，亮氨酸是一种氧化脱羧以异戊酸生成电子的底物。这些观察结果表明，尽管100个菌株在竞争相同的营养物质，但在复杂多样的菌群中，消除一个氨基酸对一个菌株生长的影响是很容易观察到的。 大多数菌株对氨基酸去除有反应的情况不超过4例（图2B）。此外，相对丰度表现出较低的变异性，菌株间log10(相对丰度)的平均标准差小于0.43。在超过4例中，只有3个株菌（均为厚壁菌门）对氨基酸去除有反应：Lactococcus lactis DSM 20729，Clostridium sporogenes ATCC 15579和Lactobacillus ruminis ATCC 25644。因此，在这些生长条件下，大多数菌株在很大程度上对氨基酸去除不敏感，而少数菌株则高度敏感。作者注意到，菌株对氨基酸去除的反应可能是直接的（如，由于能量的利用）或间接的（如，氨基酸去除影响相互作用的菌株）。 氨基酸对菌群组成的影响差异很大（图2D）。超过一半的菌株对半胱氨酸去除有反应，可能是由于它作为还原剂的作用。超过5%的菌株对去除甲硫氨酸、组氨酸、异亮氨酸、精氨酸、缬氨酸和酪氨酸有反应，而对于8种氨基酸，菌群没有明显变化（图2D）。有趣的是，相似氨基酸之间存在很大差异：没有菌株对赖氨酸的去除有反应，而10.6%和7.6%的菌株对组氨酸和精氨酸的去除有反应。异亮氨酸、亮氨酸和精氨酸的去除对菌群结构的影响尤其大：当在完全培养基中生长时，C. sporogenes和L. lactis这两种是最丰富的菌株，当这些氨基酸中的任何一种被去除时，相对丰度下降了500倍（图2E）；在生物重复实验中也观察到这种敏感性。综上所述，这些数据表明，一些氨基酸是“关键”营养素，在决定菌群组成方面起着重要作用。 6. C. sporogenes使用精氨酸产生ATP C. sporogenes uses arginine to generate ATP 在筛选的86个候选菌株-氨基酸相互作用中，对涉及C. sporogenes的相互作用特别感兴趣。虽然C. sporogenes可以氧化和还原芳香氨基酸，但其相对丰度不受苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸去除的影响。亮氨酸、异亮氨酸和精氨酸的去除对C. sporogenes生长的影响较大。第二敏感的表型是缺乏精氨酸时相对丰度的降低（图2E）；虽然已知C. sporogenes代谢精氨酸，但在先前的工作中未观察到精氨酸对生长或能量代谢的影响。为了验证和表征这种相互作用，作者比较了C. sporogenes在完全培养基和精氨酸缺乏培养基中的生长。虽然C. sporogenes在完全培养基中生长良好，但在缺乏精氨酸的情况下表现出很大的生长缺陷（图2F），表明这种氨基酸是生长的重要底物。 C. sporogenes可以利用其他氨基酸作为底物来支持ATP合成。假设精氨酸也是如此，作者在缺乏ATP合成底物的培养基中培养野生型C. sporogenes。添加精氨酸后，胞内ATP水平急剧上升（图2G），表明C. sporogenes直接或间接地从精氨酸产生ATP。 为了确定参与这一过程的酶，作者分析了C. sporogenes的基因组，以寻找已知的从精氨酸中捕获能量的途径。精氨酸脱亚胺酶途径的三个步骤中的每一个步骤都找到了候选基因（图2H）。精氨酸脱亚胺酶催化精氨酸净转化为鸟氨酸、二氧化碳和两个当量的铵，产生一个当量的ATP。利用最近开发的一种方法来构建C. sporogenes的无痕缺失，产生了缺乏精氨酸脱亚胺酶（CLOSPO_00894， Δadi）或鸟氨酸氨基甲酰转移酶（CLOSPO_02415，Δotc）的菌株。Δotc突变体不能产生ATP以响应精氨酸的供给，这与精氨酸脱亚胺酶途径在C. sporogenes能量产生中的作用一致（图2G）。相比之下，Δadi突变体在精氨酸诱导的ATP产生方面没有缺陷，这表明可能有另一种途径从精氨酸产生瓜氨酸。与这些观察结果一致，Δotc突变体在完全培养基中生长缺陷（图2F）。而是Δadi突变体是局部的，表明在这个条件下，另一种途径可以从精氨酸产生能量。总之，这些结果表明，精氨酸脱亚胺酶途径的精氨酸代谢直接有助于细胞产生ATP，增加了作者对氨基酸代谢途径如何促进复杂菌群中肠道共生适应性的理解。 7. 复杂且确定的菌群定殖无菌小鼠的特征 Attributes of a complex defined community in gnotobiotic mice 作者设计hCom1的核心目标是在宿主定殖的背景下进行微生物组的机制研究。作为体内工作的起点，用hCom1定殖无菌Swiss-Webster （SW）小鼠（图3A），通过单独繁殖每个菌株并基于OD标准化混合菌株培养物来制备hCom1。每周采集小鼠粪便，连续8周，通过宏基因组测序和NinjaMap进行序列分析对每个粪样中的菌群组成进行计数。 首先，接种物中几乎所有菌株都在小鼠肠道定殖（图3B和3C）。接种物中存在103/104菌株；其中，101个菌株至少在小鼠体内检测到一次。在小鼠中检测不到的3株菌株为：Ethanoligenens harbinense YUAN-3、Clostridium methylpentosum DSM 5476和Ruminococcus albus 8，它们生长缓慢且培养难度大。虽然菌株的相对丰度跨越了6个数量级，但在4个笼子的20只小鼠中，几乎所有菌株的变异都很低，变异系数（CV）为0.4。 其次，菌群迅速达到稳定的状态（图3D）。在小鼠中平均定殖2周后菌株相对丰度基本保持不变，不同重复实验第8周物种组成的Pearson相关系数＞0.95。第一周后，相对丰度在实验期间保持在一个狭窄的范围内（96个高于检测限菌株的平均CV＜0.2）。相对丰度变化大的菌株很少：只有27/312（8.7%）的菌株在相邻周的变化超过10倍。  图3 用复杂的肠道细菌菌群定殖无菌小鼠。 （A） 实验示意图。104个菌株冷冻保存管用于接种培养物，培养24小时，尽可能地稀释到相似的光密度并混合。将混合培养物灌胃用于无菌小鼠的定殖。在第1-5周及第8周时收集粪便样本，进行宏基因组测序，并通过NinjaMap分析每个时间点的菌群组成； （B） 大多数菌株的相对丰度分布集中。每一列描述了第4周所有小鼠中单个菌株的相对丰度； （C） 第4周接种菌相对于各菌群的平均相对丰度。菌群中的菌株在定殖小鼠肠道时相对丰度跨越了6个数量级。圆点按照（B）中的图例按门着色。数据代表实验中所有小鼠的平均值； （D） hCom1的组成在第2周时达到稳定。每个点都是一个单独的菌株；柱中圆点的集合表示单个时间点一个笼子中5只小鼠的平均菌群。根据菌株在第4周的相对丰度排序，将其着色。 8. 以生态学为基础填补菌群中开放的生态位 An ecology-based process to fill open niches in the community 虽然hCom1是由来自人类肠道微生物组的常见物种组成，但它并不像人类粪便菌群那样复杂或系统发育丰富；决定其成员资格的过程并不是为了确保任何功能或生态标准的完整性而设计的。为了创建一个确定的菌群，更好地模拟肠道微生物组，作者试图通过增加hCom1在胃肠道中填充的生态位数量来强化hCom1（图4A），因而设计了一个基于定殖抵抗原理的实验策略，这是一种生态事件，在这种生态现象中，常驻生物将入侵物种排除在已占据的生态位之外。作者用hCom1在无菌小鼠中定殖4周，推测这些物种填满了代谢和生态空间。然后用三个微生物组分不确定的粪便样本（Hum1-3）的一个入侵这些小鼠，因为入侵物种将会占据已经被hCom1填充的生态位，而生态位未被填充就会允许入侵物种与hCom1共存。四周后使用宏基因组测序分析粪便颗粒中的菌群组成。 为了确定每个粪便样本中哪些物种在hCom1存在的情况下定殖，作者分析了5-8周收集的粪便颗粒的组成，将物种划分为“输入”（hCom1来源，input）或“入侵者”（粪便样本来源，invader）。作者使用了MIDAS（这是一个列举工具，与NinjaMap不同，它不需要事先了解组成菌株）。MIDAS和NinjaMap对来自hcom1定殖小鼠读序分析的相对丰度谱高度一致，使用MIDAS对部分或完全不确定的样品进行后续分析。 使用MIDAS，无法确定在入侵前和入侵后出现的菌株是来自hCom1（即原始菌株持续定殖）还是来自粪便样本（即新菌株取代了原始菌株）。为了进一步了解菌株替换与保留，从入侵后4周（第8周）采集的样本中招募了一个由hCom1基因组序列组成的数据库，只使用与一个或多个基因组100%相同的读序。将分析重点放在高覆盖深度（≥10倍）的基因组上。这些菌株中超过60%（≥95%）被完全匹配的读序广泛覆盖，这表明大多数菌株在入侵前从hCom1保留或者是密切相关的菌株。 如预期一样，添加生理盐水的小鼠在没有显示出新物种增加 （图4B）。粪便样本入侵hCom1定殖的小鼠中，第8周平均89%的基因组拷贝来自hCom1 （58%的MIDAS-bin）（图4B）。剩下的11%的基因组拷贝（42%的MIDAS-bin）代表了来自入侵的粪便样本。尽管增加了新物种，但菌群结构保持不变（图4C）：移植后hCom1物种的相对丰度与移植前水平高度相关 （Pearson’s r ＞ 0.85）（图4D）。因此，hCom1对人类粪便的入侵具有广泛但不完全的抗性。  图4 用人类粪便菌群入侵hCom1，以确定填补开放生态位的菌株。 （A）实验示意图。用新鲜制备的hCom1定殖小鼠，并饲养4周，菌群中菌株填补了可进入的代谢和空间。在第5周开始时，用健康人类三个粪便菌群中的一个或PBS作为对照来移植小鼠。假设与hCom1具有相同生态位的粪便菌株将不能定殖，而占据其他生态位的粪便菌株将能够与hCom1共存。4周后使用宏基因组测序结合MIDAS分析了1-5周和8周收集的粪便颗粒的菌群组成，确定了在hCom1存在的情况下定殖的菌株，强化菌群以形成hCom2，然后将其用于另一轮入侵实验（图5）。 （B）hCom1对粪便入侵具有广泛但不完全的抗性。每个图都表示的是MIDAS-bin，这是种级分类群的粗线条表示。华夫图：蓝色方块表示来自hCom1的物种，灰色方块表示来自粪便菌群的物种。饼状图：hCom1和粪便菌群的MIDAS-bin的总相对丰度。从第8周开始，平均89%的基因组和58%的MIDAS-bin来自hCom1。剩下的11%的基因组和42%的MIDAS箱，代表了从一个粪便样本中加入hCom1的新物种。 （C）尽管增加了新的菌株，菌群的结构仍然完好无损。每个点都是一个单独的菌株；柱中圆点的集合表示5只共饲养的小鼠在单个时间点的菌群平均值，粪便菌群Hum1移植小鼠，根据菌株在第4周的相对丰度排序，将其着色。灰色圆圈表示来自粪便菌群Hum1的入侵物种，定义为在1-4周内未出现在所示小鼠组中的任何物种。 （D）移植hCom1后物种相对丰度与被移植前水平高度相关。在第2周和第3周，PBS对照和3个粪便菌群的平均相对丰度的Pearson相关系数（以接受相同入侵的小鼠平均表示）。相关系数显示了104个hCom1物种（实线）和包括入侵者在内的所有物种（虚线）。 9. 设计和构建一个强化的菌群 Designing and constructing an augmented community 观察到粪便入侵后形成的菌群中仅有一小部分是后来形成的新物种，作者假设可以通过添加成功入侵的物种来提高hCom1的定殖抗性，从而提高其填充肠道生态位的能力。在3个独立实验中检测到有24个细菌至少2次成功入侵了hCom1，说明24个细菌更有可能填补菌群中的生态位。作者获得了其中的22个细菌并将其全部添加到新的菌群（hCom2）（非从粪便培养），同时去除了入侵前无法定殖和迁移的7个细菌物种。因此新菌群（hCom2）包含97株来自hCom1的菌株和22株新菌株，共119株（图4A）。这22个菌株主要为厚壁菌门或另枝菌属（Alistipes），许多代表了在hCom1中系统发育上未被充分代表的分类群，这表明它们可能能够占据由hCom1成员留下的空缺的生态位（图S1）。 然后作者用hCom2定殖四组无菌SW小鼠，每周收集粪便颗粒（图4A）。使用NinjaMap分析宏基因组测序数据来测量菌群组成（图5A）。hCom2处理后小鼠的肠道菌群结构迅速达到稳定 （与第八周的稳定菌群相比，Pearson’s r ＞ 0.97）（图S2），119株中有100株高于检出限，hCom1衍生菌株在强化菌群中以相似的相对丰度定殖（图5B）。hCom2新物种的相对丰度范围跨度较大，Bacteroides rodentium成为最丰富的物种，而低丰度的Blautia sp. KLE 1732的平均丰度为10−4（图5B）。  图5 增强菌群对粪便入侵的适应能力。 （A）hCom1和hCom2的结构和菌株相对丰度比较。 （B）第4周时hCom1与hCom2中菌株的平均相对丰度。 （C）hCom2的结构在很大程度上不受Hum1-3的粪便入侵的影响。 （D）左图：hCom2比hCom1更能抵抗粪便菌群入侵。华夫图：蓝色块是源自hCom2的MIDAS-bin，灰色块是来自粪便菌群的MIDAS-bin。饼状图：来自hCom2的MIDAS-bin与粪便菌群的百分比。在Hum1-3入侵中，平均96%的基因组拷贝（以及81%的MIDAS-bin）来自hCom2，这表明通过增加从初始入侵中识别的菌株，菌群的恢复能力得到了显着提高（图4）。右图：hCom2对不相关粪便样本的入侵具有广泛的恢复能力（Hum4-6）。在这些入侵中，平均81%的基因组拷贝（和58%的MIDAS-bin）来自hCom2。 （E）第8周时，几乎所有入侵菌株都与首次粪便移植时入侵相同。入侵菌株以全彩显示，hCom2衍生菌株以低透明度表示，与第一次粪便入侵实验中一致的菌株添加黑色边框表示。 （F）入侵后hCom2衍生物种的相对丰度与入侵前水平高度相关。在第3周和第4周，PBS对照和3个粪便菌群入侵的平均相对丰度的Pearson相关系数。图中显示了hCom2中119个物种的相关系数（实线）和所有物种（包括入侵者）的相关系数（虚线）。 （G）hCom2比hCom1更接近于粪便菌群。显示了hCom1和hcom2定殖小鼠与来自三个健康人类供体之一（Hum1-3）的粪便菌群定殖小鼠的平均相对丰度。与hCom1相比，hCom2的门级结构与人源化小鼠的门级结构更密切相关。 （H）hCom2定殖小鼠与Hum1-3人源化小鼠之间门水平相对丰度的两两相关系数高于hCom1定殖小鼠与Hum1-3人源化小鼠之间的两两相关系数。 10. 强化的菌群对人类粪便菌群的入侵抗性更强 The augmented community is more resilient to human fecal challenge 构建hCom2的目的是通过其在肠道中占据生态位的能力来提高其完整性。为了测试hCom2是否比hCom1更完整，在第5周开始时用与入侵hCom1相同的粪便样品入侵hCom2定殖小鼠，以便比较入侵实验之间的结果。重要的是，用于增强hCom1的22株菌株来自培养物而不是粪便样本本身，这降低了hCom2和粪便样本在菌株水平上有重叠隶属关系的可能性。事实上，通过在hCom2中招募新生物体的基因组测序读序，发现17/22被完全匹配的读序广泛覆盖（≥95%），这与它们来自hCom2而非入侵粪便样本的观点一致。 从第8周开始，平均96%的基因组拷贝（81%的MIDAS-bin）来自hCom2中的菌株（图5C），表明hCom2的定殖抗性明显优于hCom1（图5D）。其余4%的读序（19%的MIDAS-bin）代表了在hCom2存在下入侵的物种（图5D）。几乎所有入侵hCom2定殖小鼠的物种也入侵了hCom1定殖小鼠（图5E）；要么无法获得包含在hCom2中的分离物，要么入侵hCom1的物种仅在3个粪便样本入侵实验中出现1次，低于作者的筛选标准，这些物种几乎代表了所有剩余的基因组拷贝。作者得出结论：基于一次入侵实验强化的合成菌群可能会进一步增强入侵抗性。 而且，与hCom1相比，hCom2被入侵后的组成更接近入侵前状态（Pearson’s r＞0.95；图5F）。综上所述，这些数据表明hCom2比hCom1更稳定和完整，并且在识别可以占据未填充生态位的物种时，增强过程具有鲁棒性和容错性。 在之前的实验中，作者用最初增强实验中使用的相同粪便菌群Hum1-3入侵了hCom2定殖小鼠（图4）。接下来，作者试图确定hCom2是否能够抵御不相关粪便菌群的入侵。hCom2定殖小鼠被Hum4-6入侵后的组成与Hum1-3入侵后组成不同（图4A）。hCom2对不相关的粪便样本的入侵不太稳定：从第8周开始，平均81%的基因组拷贝（58%的MIDAS-bin）来自hCom2（图5D）。因此，hCom2对不相关粪便样本的入侵具有广泛但不完全的抗性。 11. hCom2的结构类似于一个完整但不确定的人类粪便菌群 The architecture of hCom2 resembles that of a complete, undefined human fecal consortium 作者建立一个复杂确定菌群的最初目的是为肠道微生物组开发一个模型系统。在证明了hCom2对入侵具有稳定性和弹性后试图评估它是否具有模型系统的功能属性。 首先探究了其菌群结构与人类粪便菌群的结构的相似性。用3份人类粪便样本定殖无菌小鼠（Hum1-3，即人源化小鼠），并将其菌群组成与hCom2定殖小鼠的菌群组成进行比较。hCom2定殖和人源化小鼠的肠道菌群在三个方面相似（图5G, 5H）。首先，相对丰度至少跨越了5个数量级，一些菌株的定殖率保持在10%左右，而另一些则在0.001%左右。其次，对数相对丰度分布集中在低于0.01%区间，表明菌群中的大多数菌株将被0.1%的检出限的枚举工具遗漏。第三，分类群的相对丰度在属水平上是相似的。因此，hCom2定殖的小鼠菌群与人源化小鼠肠道菌群结构相似。 12. 定殖的可重复性 Reproducibility of colonization 接下来讨论了可重复性的问题，这是一个实验模型系统的基本要求。首先分析了第二次粪便入侵实验（Hum1-3）的数据，以评估hCom2定殖小鼠菌群组成的技术可重复性。第4周，同一hCom2接种剂定殖的全部4个笼中的20只小鼠肠道微生物丰度高度相似（Pearson相关系数为0.96 ± 0.01）。 生物可重复性是一个更大的问题。考虑到hCom1和hCom2的复杂性，单个菌株的生长差异可能导致不同天数构建的接种物组成存在实质性差异。为了确定这种可变性对体内菌群结构的影响程度，作者比较了四组小鼠的菌群组成，这些小鼠在不同时间被独立构建的hCom2定殖（图6A 6B）。4周后，菌群的相对丰度显示出惊人的相似性（所有生物重复对之间的Pearson大于0.95）。因此，相对恒定的营养环境可以使相对丰度变化很大的输入菌群达到相同的稳态配置，这与其他微生物组的生态观察结果一致。这种高度的生物可重复性将使使用复杂的已定义菌群作为实验模型成为可能。 为了进一步研究hCom2作为模型微生物组的潜力，作者在另外一种小鼠中进行了评估。用hCom2定殖无菌129/SvEv小鼠，并在定殖4周后收集粪便颗粒。结果显示：其菌群组成与SW小鼠高度相关（Pearson相关系数大于0.95）。这些数据表明，hCom2与人类肠道微生物组一样，对宿主基因型的变化具有很强的抵抗力。  图6 hcom2定殖小鼠在表型上与人源化小鼠相似。 （A）实验示意图。用新鲜制备的hCom2或健康人类粪便样本定殖无菌SW小鼠。一组小鼠在2周时进行免疫细胞分析；另一组在4周时用于靶向代谢物分析。 （B）小鼠hCom2的结构具有高度的可重复性。左：菌群组成在四个生物重复中高度相似；右：技术重复和生物重复的皮尔逊相关系数。 （C）hCom2定殖、hCom1定殖和人源化小鼠在体内具有相似的细菌密度。 （D）hCom2定殖小鼠和人源化小鼠的免疫细胞类型和数量大致相似。从hcom2定殖、人源化或无菌小鼠提取结肠免疫细胞，对细胞表面标记物进行染色，并用流式细胞术进行评估（** p < 0.001）。 （E）hCom2定殖小鼠和人源化小鼠具有相似的微生物组衍生代谢物谱。采用靶向代谢组学方法对hCom2定殖小鼠和人源化小鼠的尿液样本进行分析，通过LC-MS测量一组芳香氨基酸代谢物 （∗p < 0.05; ** p < 0.001）。 （F）从hCom2定殖和人源化小鼠收集的粪球中提取胆汁酸，并通过LC-MS进行定量，DEF中均采用双端学生T检验。 13. hcom2定殖小鼠在表型上与人源化小鼠相似 hCom2-colonized mice are phenotypically similar to humanized mice 进行了三个额外的实验来确定hCom2定殖的小鼠与人类粪便菌群定殖的无菌小鼠的相似程度。由于确定的菌群是由人类粪便分离物组成的，作者将确定的hCom2菌群或微生物不明确的人类粪便菌群处理无菌小鼠，并在4周后检测表型（图6A）。首先，将每只小鼠的粪便颗粒梯度稀释，并涂于哥伦比亚血琼脂培养皿上，以估计每个菌群的细菌细胞密度。每组每克粪便含有1011~1012个菌落形成单位（图6C），与已报道的人类、传统小鼠和人源化小鼠的估计相似。因此，hCom2在小鼠肠道中的定殖密度与正常小鼠或人类粪便菌群相似。 接下来，作者研究了hCom2定殖小鼠是否具有与人源化小鼠相似的免疫细胞谱。作者提取了结肠免疫细胞并对其进行染色和流式细胞检测，发现大多数免疫细胞亚型，包括CD4+ T细胞、IgA+ B细胞、巨噬细胞、CD11b+树突状细胞和单核细胞，在人源化小鼠与hCom2定殖的小鼠中同样丰富（图6D），表明hCom2定殖小鼠与人源化小鼠在广义上的免疫细胞谱相似。 最后，为了确定hCom2定殖小鼠和人源化小鼠是否具有相似的微生物组代谢物，作者使用靶向代谢组学分析了粪便颗粒和尿液样本。结果显示，hCom2定殖小鼠和人源化小鼠尿液中的芳香氨基酸代谢物水平（图6E）和粪便中的初级和次级胆汁酸水平（图6F）是相当的。综上所述，这些数据表明hCom2是一个合理的肠道微生物代谢模型。 14. hCom2对致病性大肠杆菌具有强大的定殖抗性 hCom2 exhibits robust colonization resistance against pathogenic Escherichia coli 为了证明其作为模型系统的实用性，作者使用hCom2来研究肠道菌群的一个新特性：它们抵抗病原体定殖的能力。为了测试hCom2是否具有定殖抗性，作者研究了肠出血性大肠杆菌（EHEC） Escherichia coli ATCC 43894。选择这个物种的三个原因是：首先，肠出血性大肠杆菌会导致危及生命的腹泻感染和溶血性尿毒症综合征，其他大肠杆菌菌株的肠道定殖与营养不良和炎症性肠病有关；其次，对大肠杆菌和其他肠杆菌科的定殖抗性进行了详细研究，但负责的共生菌株及其作用机制尚不完全清楚；最后，hCom2没有肠杆菌科，只有3种变形菌门（Desulfovibrio piger, Bilophila wadsworthia和Burkholderiales bacteria 1-1-47），因此，对大肠杆菌定殖抗性需要用除生态位的另一种生态位进行解释。 为了测试hCom2是否能够抵抗肠出血性大肠杆菌的入侵定殖，分别用hCom2、12Com（类似于先前研究中使用的12个成员菌群）和来自健康人类的不确定粪便菌群定殖无菌SW小鼠 （图7A），hCom2和12Com不含任何肠杆菌科。为了测试非致病性肠杆菌科是否增强了对肠出血性大肠杆菌的定殖抗性，作者在另外在定殖的hCom2和12Com菌群中添加了7种非致病性肠杆菌科菌株的混合物（大肠杆菌MITI 27、MITI 117、MITI 135、MITI 139、MITI 255、MITI 284和阴沟肠杆菌MITI 173；称为“Enteromix”）。4周后，用肠出血性大肠杆菌入侵，并在好氧生长条件下通过选择性平板涂布培养检测入侵情况（图7A）。 与先前的报告一致，不确定的人类粪便菌群对肠出血性大肠杆菌定殖具有强大的抵抗力（图7B和7C）。相比之下，12Com允许更高水平的肠出血性大肠杆菌定殖，并且在12Com中添加Enteromix改善了表型，但没有完全恢复对肠出血性大肠杆菌的定殖抗性（图7B）。缺乏肠杆菌科hCom2表现出与不确定的粪便菌群相似的肠出血性大肠杆菌抗性水平（图7B）。因此，hCom2能足够完整地表现出与原生粪便菌群相当的定殖抗性。 为了确定hCom2中哪些物种负责肠出血性大肠杆菌定殖抗性，作者构建了四个菌群，依次去除了厚壁菌门，疣微菌门，放线菌门和变形菌门的所有物种，将这些门缺失菌群定殖在小鼠体内，然后用肠出血性大肠杆菌进行入侵 （图7D）。放线菌门菌群缺失（10株）和疣微菌门菌群缺失（1株，Akkermansia muciniphila）对肠出血性大肠杆菌的抵抗性与hCom2菌群相当（图7E和7F），而变形菌门或厚壁菌门菌群缺失的合成菌群更容易受到肠出血性大肠杆菌入侵。 厚壁菌门菌群缺失的合成菌群（ΔFirmicutes）对肠出血性大肠杆菌入侵高度敏感（图7E），该缺陷导致hCom2定殖小鼠和ΔFirmicutes定殖小鼠之间的生存差异很大（图7E右）。这些结果表明，厚壁菌门可能在肠出血性大肠杆菌抗性中发挥作用，或者它们的去除引起菌群结构变化使菌群对入侵敏感。通过更精确的菌株去除实验进行进一步研究可能会发现具有抵抗肠出血性大肠杆菌入侵的菌株，有助于针对性的微生物治疗以抵抗肠出血性大肠杆菌定殖和感染。 - 讨论 - 通过开发一个既明确又相当复杂的菌群生成了一个模型系统，该系统捕获了原生微生物组的大部分生物学特性。但是该模型在未来仍然需要改进，包括额外的细菌、古细菌、真菌和病毒来占据未填补的生态位，这些都肠道生态系统的重要组成部分。 测序数据比对计算流程开发使得分析复杂且明确的菌群具有较高的精度和灵敏度。这个方法可以量化相对丰度跨越6个数量级的菌群结构，从而可以揭示在菌群功能和动态中发挥重要作用的低丰度菌群成员。在如此复杂的系统中，技术和生物可重复性的程度（图6B）是显著的，这对未来的实验工作来说是个好兆头。 在强化一个已明确菌群的过程中有两个意想不到的发现。首先，由来自100个不同供体的菌株组成的菌群在体内是稳定的。在由单一供体（菌株共存多年）和多个供体（菌株没有共存历史）组成的菌群之间，是否存在明显的稳定性差异（或精细尺度的基因组和表型适应性差异）还有待观察。如果一个没有共同历史的菌株集合可以形成一个稳定的合成菌群，那么确定优先效应（即到达顺序）及空间和代谢生态位占据的作用将是有趣的。 其次，本研究中强化菌群的过程具有出乎意料的稳定性和容错性。最值得注意的是，所有入侵hCom1的来自粪便菌群菌株如Alistipes，Blautia，Bilophila，Oscilibacter和变形菌门在hCom1中系统发育缺少（图S1）。此外，大多数入侵hCom2的菌株都曾入侵过hCom1，表明生态位填充是确定性的。重要的是，强化过程对现有菌群的结构造成的扰动相对较小。虽然扩充强化过程只能填补从小鼠到人类保守的生态位，但大多数人类菌株移植的观察表明，许多生态位是保守的。 如果扩大菌株选择标准，可能进一步提高菌群一轮强化后的定殖抗性。若要进一步增强生态位填充和菌群稳定性，可以使用来自不同饮食的其他供体粪便样本对hCom2强化。它也可能改善生态位占用，如在肠道炎症的情况下，通过在炎症性肠病的小鼠模型中执行增强过程。 目前迫切需要一种通用的肠道微生物组模型系统，该系统必须是完全确定的且足够复杂以维持一个完整菌群的大部分生物学特征。作者表明，hCom2是这样一个系统的基础：尽管它很复杂，但它以一种高度可复制的方式在小鼠中定殖。此外，hCom2忠实地模拟了人源化小鼠的生态容纳量、免疫细胞谱和代谢表型。在代谢和免疫方面仍然存在一些适度的差异，并且该菌群仍然缺少某些可能重要的分类群。尽管如此，综合起来，作者的研究结果表明hCom2是建立肠道微生物组模型的合理基础。 这种系统最有趣的可能性之一将是在菌群移植实验的下游进行还原论实验（例如，识别负责微生物组相关表型的菌株）。虽然没有确定对肠出血性大肠杆菌产生定殖抗性的菌株，但作者发现，去除变形菌门或厚壁菌门的物种会使菌群对肠出血性大肠杆菌敏感。在未来，尝试一次从菌群中去除一个或几个菌株可以进一步缩小从门水平到单个菌株的范围。鉴定微生物组相关表型的菌株，包括对癌症免疫治疗的反应，热量收获和神经发育，将会引起极大的关注。 - 研究的局限性 - 研究有三个重要的局限性。首先，尽管hCom2对原强化过程中的粪便菌群入侵抵抗是稳定的，但对不相关的粪便菌群的入侵抗性不太稳定。这些数据表明，后续的强化扩充——使用一系列或平行的各种不相关的粪便样本——是获得更稳定的hCom2变体的有希望的途径。 其次，目前尚不清楚需要多少细菌菌株（或其他成分）来模拟原生人类微生物组的全部功能。先前观察到的典型人类微生物组中物种数量约为150-300。尽管如此，观察到只有119个确定菌株的菌群表现出显著的稳定性，有助于今后的研究。作者估计hCom2在原生尺度复杂度的一半以上，因此一个全尺寸系统在实验上是可行的。作为构建这样一个系统的起点，hCom2将为评估模型菌群的基因组和功能完整性提供一个标准，最终目标是建立原始尺度的人类微生物组模型。 第三，菌群之间的菌株水平差异是微生物组赋予宿主的一些表型差异的基础。hCom2仅代表一个菌株联合体，无论是hCom2还是其他单一菌群都不能模拟菌株水平变异对宿主表型的影响。然而，作者认为一个确定的菌群是探索菌株水平差异的一个有希望的起点：一组物种相同但含有不同菌株的的菌群将是探索菌株变异（甚至单个基因）对表型的影响的理想方法。 参考文献 Cheng A G, Ho P Y, Aranda-Díaz A, et al. Design, construction, and in vivo augmentation of a complex gut microbiome[J]. Cell, 2022, 185（19）: 3617-3636. e19. - 通讯作者简介 - |
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