【原】AAV基因治疗在眼科疾病研究中的应用及常见注射方

本文中将对眼部常用注射方法予以详细介绍，供大家在注射方法选择及操作时参考。

1.前房注射

前房是角膜和虹膜之间的腔隙，为房水所充盈。小鼠巨大的晶状体向前房隆起，小鼠的前房相对比人体的要浅得多。小鼠前房注射液体或气体可以提高眼内压，是制作青光眼模型的方法之一。具体操作步骤如下：

▶ 实验前准备

麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。

▶ 前房注射

用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器从虹膜上1-2mm处插入前房，针尖平行进入，随后快速推注病毒，形成空气，使气泡正好在针头上，堵住针口，防止漏液。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。

▶ 动物复苏

将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。

                                                                       图2 前房注射

2.玻璃体腔注射

▶ 实验前准备

麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。

▶ 玻璃体腔注射

用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔内，针尖先垂直进入，随后倾斜，慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。

▶ 动物复苏

将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。

图3 玻璃体注射

3.视网膜下注射

小鼠的后半眼球壁由内向外分为视网膜、脉络膜和巩膜。小鼠视网膜结构与人体类似（图4），注射具体操作步骤如下：

图4 C57BL小鼠视网膜组织HE染色图（400×）

▶ 实验前准备

麻醉小鼠：在小鼠称重后，经腹腔注射适量的1%戊巴比妥钠溶液，放置于饲养笼内，等待麻醉约5-10min。小鼠麻倒后，眼球表面滴入扩瞳剂使其散瞳。

▶ 病毒注射

用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，左手按住头部，使其眼球部分突出，右手持微量注射器自角膜后缘1mm位置插入玻璃体腔，针尖先垂直进入，随后倾斜，直至对侧视网膜（经玻璃体腔注射），有阻力时停止进针，慢慢推注病毒。或者用注射器针头与眼轴呈15°角在动物暴露出的距角膜缘1-2mm处巩膜开一个扎破巩膜但不穿透RPE的通道，针头斜面没入即停止进针（经巩膜注射），慢慢推注病毒。病毒注射完毕，缓慢抽出针头。

▶ 动物复苏

将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。

4.结膜下注射

结膜下注射是眼局部给药的常用方法。具体操作步骤如下

▶ 实验前准备

麻醉小鼠，等待约5-10min，滴入扩瞳剂。

▶ 病毒注射

用微量注射器吸取适量病毒备用，取麻醉后的小鼠置于操作台上，眼部给予盐酸利多卡因进行局部麻醉，用镊子夹起结膜，沿结膜内侧刺入3-4mm，可透过结膜观察到针头的走向，慢慢注射病毒，注射完毕，停留数秒拔针，注射后可见球结膜下有隆起，眼球突出。

▶ 动物复苏

将小鼠放回饲养笼内，注意保温，待其苏醒。

图6 结膜下注射

参考文献：

[1]She, K., Su, J., Wang, Q., Liu, Y., Zhong, X., Jin, X., ... & Wei, Y. (2022). Delivery of nVEGFi using AAV8 for the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 24, 210-221.

[2]Buck, T. M., & Wijnholds, J. (2020). Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV)-vector elements in ocular gene therapy clinical trials and transgene expression and bioactivity assays. International journal of molecular sciences, 21(12), 4197.

[3]Telias, M., Denlinger, B., Helft, Z., Thornton, C., Beckwith-Cohen, B., & Kramer, R. H. (2019). Retinoic acid induces hyperactivity, and blocking its receptor unmasks light responses and augments vision in retinal degeneration. Neuron, 102(3), 574-586.

[4]Lee, S. H., Kim, Y. S., Nah, S. K., Kim, H. J., Park, H. Y., Yang, J. Y., ... & Park, T. K. (2018). Transduction patterns of adeno-associated viral vectors in a laser-induced choroidal neovascularization mouse model. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 9, 90-98.

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