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各位老师好！我是“一麦众承”第14组“铸麦逐梦”的李玮（山东省农科院作物所）。按照组长焦作农林科学研究院作物所杜立丰老师安排，今天由我代表小组值日。我们组成员还有中国科学院遗传发育所卫波老师，漯河市农业科学院张中州老师，偃师市府店镇农业服务中心张三坤老师，豫粮集团延津小麦产业有限公司秦志英老师，漯河市农业科学院望俊森老师，山西农业大学小麦研究所杨斌老师，河南省农科院昝香存老师，中国农科院棉花所徐开杰老师，河南众农禾农业发展公司李继萍老师，西北农林科技大学农学院宋瑜龙老师。
我于2016年正式加入山东省农科院作物所分子育种课题，课题组有两个主要方向，基因编辑（转基因）和分子育种。宋国琦老师和我主要从事分子育种工作，而我的工作重点是小麦分子标记辅助选择。下面简要介绍一下我们开展的工作，不当之处敬请各位老师批评指正。
1. 小麦分子育种共享平台
2012年Liu Yanan等在TAG发表了题为“Functional markers in wheat: current status and future prospects”的文章，系统总结了包括小麦加工品质、农艺性状和抗病性相关的97个小麦功能标记。在此基础上，我们通过文献检索共收集了小麦分子标记311个，再加上审定品种的分子标记检测数据和品种表型数据，构建了“小麦分子育种共享平台”并实现了网络访问。小麦分子育种共享平台没有注册域名，只能通过IP地址访问。为了方便使用，我们在作物所网站的管理平台模块中设置了超链接。2022年8月12日，我们收到济南市网信办关于“小麦分子育种共享平台”存在弱口令漏洞安全隐患的通报，所以关闭了网络IP映射，目前外网无法访问。截至关闭时，共有注册用户100多个。有老师留言反映和我们有相似的想法，希望能开展合作，证明我们的工作是有意义的。为了更好地服务分子育种，增加数据量，完善系统功能，我们计划升级小麦分子育种共享平台至2.0版本。遗憾的是当时开发该系统的公司已经更换了法人，其工程师也已经离职。恰逢山东省农科院成立了大数据研究院，经协商和沟通小麦分子育种共享平台2.0正在开发当中，希望2.0版本能尽快上线供大家使用。
2. 小麦KASP标记体系建立
在对收集的STS、SCAR、CAPS等分子标记检测过程中发现部分标记存在扩增不稳定，非特异扩增较多，酶切效率低等问题。2016年Awais Rasheed等在TAG发表了题为“Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat”的文章，报道了70个小麦KASP标记，和通过凝胶电泳进行检测的分子标记相比，通过荧光检测的KASP标记检测效率得到了大幅提高。KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)直译为竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应,是一种利用荧光标记检测SNP或Indel的技术。因其具有简便、灵活、高效的优势，逐渐被广泛使用，缺点是需荧光检测设备。恰逢小麦分子育种团队获项目经费资助，采购了LGC公司的荧光检测仪PHERAstar，因此我们的分子标记全面转向KASP标记。
KASP技术已经很成熟，直接拿来用按说没有问题。然而KASP标记在我们实验室使用并不是一帆风顺的。刚开始尝试时选择了4个标记，Lr46_JF2-2、Lr34_TCCIND、TM4和Sr2_ger9 3p。除Lr46_JF2-2在第一次检测成功外，其他三个标记第一次检测均未成功，而Lr46_JF2-2在实验室搬家后无论如何也重复不出来。在长时间尝试未果的情况下，只好与Awais Rasheed发表文章的通讯作者中国农科院作物所夏先春老师联系，去他们实验室学习。用自带的DNA，引物和MasterMix与夏老师实验室的DNA，引物和MasterMix组合测试。经过几天的实验，带来的DNA用完了，虽然没有彻底解决问题，但是明确了KASP PCR程序没有问题，DNA的浓度可以适当提高，并且拿到了一份检测效果较好的小麦KASP标记引物表。在将新的引物送去合成的同时，恰好武汉景肽生物的杨燕宇博士来推广他们自主研发的SNP分型检测体系PARMS，在交流过程中了解到引物的纯化方式也可能会影响KASP或PARMS反应。普通PCR反应一般采用脱盐纯化即可，但对于KASP或PARMS选择PAGE纯化效果可能会更好一些。于是重新合成了最初尝试的4个标记的引物，测试后Lr46_JF2-2和TM4成功分型，而Lr34_TCCIND和Sr2_ger9 3p依然无法分型。将夏老师实验室检测效果较好的小麦KASP标记进行测试，基本上都能成功分型。至此KASP标记检测在我们实验室才算基本建立。而Lr34_TCCIND和Sr2_ger9 3p无法分型的原因只剩下引物问题。将标记扩增序列与中国春参考基因进行比对，发现Lr34_TCCIND（7D）在7A和4A有高相似度序列，另外引物Tm值也偏低，而Sr2_ger9 3p(3B)在3B和3D有多个高相似度序列。这些高相似度序列是产生非特异扩增导致KASP检测失败的原因。Lr34_TCCIND检测的Indel区域GC含量太低，不适合设计KASP引物，改用该基因第12外显子上的SNP位点设计引物，开发了KASP标记C6K2C1。重新设计Sr2_ger9 3p的共用引物，开发了KASP标记Sr2K3。两个标记均获得了较好的检测效果。
Sr2K3检测结果
3. KASP标记检测
KASP标记检测方法建立后，首先利用42个分型较好的KASP标记对我们保存的94份育种亲本进行了检测，结果表明1B/1R易位系约占三分之一；RhtD1是主要的矮秆基因，占比接近80%；与产量相关的TaCwiA1、GW26B、Sus17B优异等位变异占比均大于85%，而TaGS2B、GS5、TaGW26A、TEF7A1在30%左右，TaGASR和TaMoc7A小于10%；与品质相关的GluA1、LoxB1、PinbD1优异等位变异占比70%左右，而ZdsD1高达99%，GluD1、ZdsA1、PdsB1在25%左右；与抗性相关的Lr46优异等位变异占比92%，fehw3为65%，Vp1B和Lr14a在50%左右，SDR为21%，Lr68为15%，而Fhb1、Sbmp、Lr34、Sr2、Pm21在5%以下；光周期、春化和开花期相关的基因优异等位变异占比均较高。明确了育种亲本的优异等位变异组成情况，为优异等位基因的利用奠定了基础。
随后我们对2019-2020山东省小麦区试高产组和优质组的126份品系进行了64个KASP标记的检测。区试品系代表了一定区域内的育种水平，虽然只有少部分品系能通过审定成为品种，但明确其重要性状功能基因的组成对未审定品系的改良和审定品种的育种利用均有重要意义。明确区试品系已知基因的基因型，不仅可以指导实践，用于亲本组配，还可以在后代选择过程中取长补短，将更多的优异基因型聚合在一起，从表型和基因型两个方面来选择，提高选择效率。
紧接着我们尝试了将育种亲本的优异等位变异组成情况用于辅助大田选择。根据大田种植的F5和F6品系亲本组合，筛选出了每一个组合的差异基因，对同一个组合的所有品系进行KASP标记检测和比较，明确品系间优异等位变异组成情况，可作为品系决选的参考指标。然后遗憾的是KASP标记检测含有最多优异等位基因的品系并不是大田表型选择保留的品系，不由得感叹表型太复杂而我们知道的还太少。
4. 分子标记辅助选择创制种质材料
虽然利用少量的标记直接辅助大田选择不可行，但是利用KASP标记进行基因聚合和种质材料创制可以达到事半功倍的效果。多效抗病基因是小麦中发现的一类宝贵基因资源，已报道的多效抗病基因至少有3个（Lr27/Yr30/Sr2是一个基因还是多个基因有待证实），包括Lr34/Yr18/Pm38/Sr57、Lr46/Yr29/Pm39/Sr58和Lr67/Yr46/Pm46/Sr55。它们对小麦三种锈病和白粉病同时具有抗性。利用多效抗病基因培育兼抗型品种是防治小麦锈病和白粉病经济有效的途径。济麦229是山东省农科院作物所审定的优质强筋小麦，品质性状优秀但感白粉病和锈病。以济麦229为受体，采用复交+回交方式结合分子标记辅助选择将3个多效抗病基因和Sr2导入济麦229，获得了BC4F3株系，其成株期白粉病和叶锈病抗性得到明显提高，但干叶尖加重，且扬花前后叶片出现白色小斑点，可能对产量有影响，品质性状是否明显改变也需要繁种后进一步分析。
BC4F3株系大田长相
5. KASP标记代测
在KASP标记检测积累了经验之后，我们也开始尝试开展小范围内的代测服务，以合作的方式，不收取费用。因为人员较少，我们要求提供DNA才能检测，所以检测量都很少。最先和我们联系的是甘肃省农科院白斌老师，为其检测了Sr2基因，但是结果和他们用普通PCR检测的结果不太一致，由于没有进行对比验证，所以不确定检测结果不一致的原因。接着与本单位种质资源课题合作，对他们保存的部分种质资源进行了KASP标记分析，以明确种质资源中携带的优异等位基因。随后为本单位小麦育种课题和济宁市农科院陈贵菊老师进行了高分子量谷蛋白亚基、抗病基因等的KASP检测，用于辅助亲本选择和后代目标基因跟踪。真正的大量代测服务是为鲁研公司开展的抗赤霉病基因Fhb1检测，2000多个样品从DNA提取到给出KASP检测结果用时10天，个中曲折和辛苦一言难尽。这是我们唯一一次代提DNA（因为鲁研公司没有提DNA的条件），也让我们意识到在缺乏人员的情况下代测KASP标记必须要求提供DNA。
6.未来展望
小麦基因组的复杂性导致KASP标记在实际使用中并不像在水稻中那么简单，还存在假阳性、假杂合、分型效果差等问题，部分SNP位点甚至无法转化成KASP标记，但是KASP标记优势明显，被越来越多的科研人员开发和使用。在开展KASP标记转化和应用的同时，我们也在继续收集最新发表的分子标记，将非KASP标记转化成KASP标记用于辅助选择，希望能和更多的育种家开展合作，促进KASP标记在育种中的应用。随着越来越多的功能基因被克隆，开展KASP标记辅助选择是将功能基因用于育种的有效方法，可以提高选择准确性和育种效率。希望我们的工作能够促进常规育种与分子育种结合，为我国小麦育种事业增砖添瓦。
作者简介：李玮，男，汉族，1982年12月生，陕西蓝田人。本科、硕士、博士均毕业于西北农林科技大学。现为山东省农科院作物所助理研究员。主要从事小麦分子标记辅助选择育种工作，参与选育小麦新品系济麦349、济麦025，发表论文5篇，联系方式：15165132317（微信同号）。 |
