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“月宫365”实验表面真菌多样性和真菌毒素基因  Research Article, 2022-10-12, Microbiome, [16.837] 第一作者：杨建楼 通讯作者：付玉明，刘红 主要单位：北京航空航天大学 DOI: https:///10.1186/s40168-022-01350-8 原文链接： https://microbiomejournal./articles/10.1186/s40168-022-01350-8#Sec19 摘 要 月宫一号（中国）作为一个地基生物再生生命保障系统（BLSS）实验平台，实现了植物栽培、动物蛋白生产、尿氮循环以及固体废物生物转化等的高度一体化。迄今为止，针对BLSS生境中真菌群落及其潜在毒力的研究尚有空缺。为了保障真实空间环境中BLSS的构建。本研究中，作者全面表征了“月宫365”实验中分离的真菌群落结构以及其毒素产生相关基因，进一步使用qPCR和扩增子测序探索两组乘员入驻期间月宫一号表面真菌群落结构以及其毒素产生相关基因存在的差异，并将结果同ISS、ILMAH、AIT等PCSS系统进行比较。结果表明，月宫一号具有与其他封闭生境相比差异极大的真菌群落，具有更高的alpha多样性和不同的群落结构。植物是表面真菌微生物群最重要的来源。然而，在BLSS中，乘员更替可以引发表面真菌群落结构的强烈扰动。植物栽培会减少这种扰动，并保持表面真菌微生物群落和潜在毒性处于平衡状态。这项研究为：（i）载人航天与长期地外驻留任务的风险评估；（ii）太空中人员转移和植物种植任务的设计和优化；（iii）进一步研究室内植物源真菌群落，提供了重要数据。研究结果为闭合人工生态系统中真菌群落的研究提供了新研究方向，同时利于真菌污染控制策略的制定以维持BLSS乘员的健康，进而促进地外生存研究领域的发展。 背 景 在未来，载人深空探索，如人造月球基地的建设和火星的探索，会需要建设安全、封闭的居留地，生物再生生命支持系统（BLSS）则是居留地的核心组成部分。BLSS是一种小型的、平衡的、自适应的人工生态系统，能为密闭隔离环境中的工作人员提供了空气、食物和水循环。长期以来，生物污染一直是建筑设计领域中备受关注的课题，尤其是在BLSS这种密闭环境中。真菌所分泌的毒素对人体健康的危害比有毒的细菌代谢物更强，使其在室内环境评估中受到了更密切的关注。已有数个研究表明室内环境中真菌会导致许多健康问题，如皮肤病和病态建筑综合征。多重真菌所产生的毒素是造成这些问题的重要原因之一，这些活性化合物甚至在真菌死亡后依然会弥漫在四周的环境中。真菌毒素是一种重要的污染物，因为它可以在极低浓度（ppb到ppt）时引起人类的急性和慢性中毒。由于室内环境中的真菌毒素种类繁多，所以目前常见的分析方法都专注于判别部分毒理学意义较强的真菌毒素的存在。因此，本研究还考虑了真菌毒素污染密闭环境的可能性。 近期，有研究针对真实的物理化学再生生命保障系统（如国际空间站，ISS）、地面类似物（如模拟月球\火星基地，ILMAH）以及ISS相关的航天器组装与集成测试中心（AIT）的受控环境中的真菌群落进行了调查，认为物体表面是乘员接触真菌及其分泌毒素的主要途径。而BLSS独有的生物层级，尤其是植物集约化栽培模块，致使BLSS的设计框架与物理化学再生生命保障系统（PCSS）完全不同。因此，研究类似的环境中的真菌群落以及其潜在毒性是确保未来地外BLSS安全设计的重要一环。然而迄今为止，关于类BLSS环境中真菌群落以及其毒素基因的研究尚有空缺。 结 果 1. LP1环境微生物组与其他密闭环境微生物组的比较 将从国际空间站尘埃，AIT表面和ILMAH表面收集的公开样品序列与LP1环境真菌微生物组进行比较。与其他密闭环境相比，LP1中的真菌α多样性明显更高（图1a），LP1表面上的真菌微生物组是独一无二的（图1b）。根据Bray-curtis距离，PC1和PC2占总变异的30.55%和16.53%。PERMANOVA分析显示与对照环境存在显着差异（P = 0.001）。在门水平上，密闭环境中含有较高的子囊菌和担子菌的相对丰度，我们还在LP1环境中发现了729种独特的真菌ASV（图1c-d）。  图1 LP1和其他密闭环境中真菌微生物组的一般表征。 a 真菌群落的α多样性。b 不同密闭环境之间真菌群落的β多样性估计数（PERMANOVA，P < 0.05）。c 真菌微生物群落中存在的主要门的相对丰度（%）。d 在真菌微生物群落中观察到的共享和独特ASV数量的韦恩图。LP，月宫一号；ISS，国际空间站；AIT中心，装配，集成和测试中心，ILMAH，充气月球/火星模拟栖息地。 2. 乘员对表面真菌微生物组的影响 使用不同的指数（Chao1，ACE，Shannon和Simpson）全面评估了表面微生物组的真菌α多样性。所有指标均显示与G1相比，G2引入了明显更大的真菌群落多样性（图2a）。PCoA表现出不同程度的聚集性和对G1和G2真菌群落总变异的不同解释。G1期真菌主要由子囊菌门组成(65.05%)，而G2期真菌在门水平上主要由子囊菌门(58.15%)和担子菌门(23.66%)组成（图2c）。在属水平上，我们进行了LEfse分析(Kruskal-Wallis；P < 0.05，LDA评分>2.5；图2d)比较两组之间相对丰度的显著差异。  图2 LP1环境样品的真菌微生物组图谱。 a 真菌群落的α多样性估计(Wilcoxon等级检验，P < 0.05)。b 对于两组之间的ITS1数据集，在ASV级别执行PCoA(未加权UniFrac距离)。G1，第一组乘员；G2，第二组乘员。c 与G1和G2相关的真菌门的相对序列丰度。d Lefse分析确定了G1和G2之间差异丰富的属(LDA显着性阈值 > 2.5)。 3. 采样位置对表面真菌微生物组的影响 来自同一乘员组不同地点的样本的差异小于来自不同乘员组的同一地点的样品。由于人员组成不同，CC（综合舱）和SC（固废处理舱）中设备表面的真菌群落存在显著差异，而PC（植物舱）上则无显著差异。为了将关键真菌类别识别为生物标志物分类群，以与LP1中的不同位置相关联，进行了十次交叉验证，重复了五次。使用 47 个重要类时获得的最小交叉验证误差。然而，当使用23个类时，交叉验证误差曲线的类数稳定下来（图3a）。因此，我们将这23类定义为模型中的生物标志物分类群。图3a提供了LP1中不同位置的23个类级最丰富的真菌类群的列表，按位置区分重要性排序。大多数生物标志物分类群，如地霉菌和甲壳虫，在植物舱中显示出较高的相对丰度（图3b）。  图3 与LP1中不同位置相关的真菌生物标记物。 a 采用随机森林方法，按照贡献从大到小的顺序，确定了与所示地点有关的23个属。b 热图显示了23个与位置相关的生物标志物的相对丰度。CC，综合舱；PC，植物舱；SC，固体废物处理舱。
我们定量分析了真菌负荷的ITS区域的拷贝数，以及真菌毒素的五个代表性基因（idh，ver1，nor1，tri5，ITS1），因为这些真菌毒素对人类健康和植物食品安全都具有最大的意义。真菌毒素基因拷贝数总体上或组间均无显著差异（图4a）。虽然真菌毒素基因拷贝数和真菌负荷（ITS区扩增子）随时间波动性较小，但在整个时间序列中总体上没有显着差异（图4b–c）。真菌毒素基因丰度与表面菌群相对丰度之间的Spearman相关系数如图4d所示。真菌丰度与真菌毒素基因之间存在较强的正相关。  图4 真菌毒素基因的变化、变异和相互关系。 a 不同乘员群体间各真菌毒素基因拷贝数的比较。b 真菌毒素基因拷贝数和微生物数量随时间的变化。c 不同采样时间下真菌毒素基因表达的比较。d 真菌毒素基因与表面真菌群落的相关网络分析(P < 0.05，Spearman系数 > 0.4)。每个节点代表隶属于属水平的类群(基于ITS1 rRNA)，每个节点的大小与属的相对丰度成正比。节点之间的线表示属之间的积极联系。每个节点都在模块级别标记。 5. LP1中表面真菌的溯源 最后，我们根据代表潜在源环境的公开数据集评估了我们的数据。我们发现LP1中表面真菌来源的以下细分：植物，68.75%；未知，28.12%；人类，3.08%；和室内空气，0.05%（图5）。大多数真菌多样性与植物真菌多样性和人类皮肤真菌多样性相关。前者显示出更大的比例，表明植物对LP1表面真菌群落谱的影响更为显著。  图5 使用FEAST测量的LP1内与表面相关的真菌的溯源。 讨 论 本研究表明，LP1系统作为BLSS模拟，在真菌群落多样性方面表现出与其他密闭生境的显著差异，真菌α多样性更高，群落结构不同。研究还揭示了一个多样化和独特的表面真菌种群，这些真菌种群在乘员轮班中发生了变化。此外，植物是表面真菌最重要的来源，对维持BLSS内真菌群落的多样性、独特性和稳定性具有重要意义。乘员之间，时间点之间或不同位置之间的真菌毒素基因没有显著差异。我们的发现可用于帮助开发安全，封闭的生态系统，以满足深空人类居住的要求。此外，我们的结果可能会对我们对包括植物生长在内的工作和生活环境中的微生物安全性的理解产生重大影响。 参考文献 Yang J, Hao Z, Zhang L, Fu Y, Liu H. Surface fungal diversity and several mycotoxin-related genes' expression profiles during the Lunar Palace 365 experiment. Microbiome. 2022 Oct 12;10(1):169. doi: 10.1186/s40168-022-01350-8 第一作者简介  杨建楼：北京航空航天大学生物与医学工程学院博士研究生，博士课题为生物再生生命保障系统中环境微生物的动态与控制研究，研究方向为利用生物信息学、分子生物学、以及数学模型等方法进行环境微生物学研究。目前以第一作者发表了1篇Microbiome 、1篇Environmental Microbiome，在中国科技核心期刊发表论文2篇。 通讯作者简介  付玉明：北京航空航天大学副教授，博士生导师。主要研究方向为面向航天生命保障的居室环境-微生物组-人体健康轴研究（利用宏基因组组学、代谢组学、转录组学、培养组学等多种方法结合，研究模拟微重力、电离/光照辐射、密闭隔离环境等因素下微生物组与其他生物界面、非生物界面的相互作用，并结合微流控技术与纳米技术对微生物群进行监测、改良与健康应用）。研究成果发表在Nature Comm、Microbiome、Nano Today等期刊，授权中国发明专利 9 项；入选 2016年教育部十大科技进展奖、国防技术发明二等奖，荣获中国青年五四奖章集体荣誉。先后主持载人航天预研项目、国家自然科学基金项目、国家重点研发计划子课题等若干项。  刘红：北京航空航天大学教授，博士生导师，俄罗斯自然科学院外籍院士，国际宇航科学院院士，月宫一号总设计师。2006年在北京航空航天大学生物与医学工程学院任教授工作至今。担任空天生物技术与医学工程国际联合研究中心执行主任，空间生命科学与生命保障技术中心主任，环境生物学与生命保障技术所所长。主要研究方向包括特殊环境生命保障和生物安全、光生物学与光保健、肠道微生物学与精神健康、高端植物工厂等。近年来发表论文100余篇，其中SCI 论文70余篇，共授权中国发明专利20余项。研究成果入选 2016年教育部十大科技进展奖、国防技术发明二等奖，荣获中国青年五四奖章集体荣誉。2019年1月，被评为2018年度十大女性新闻人物。2019年9月，中华人民共和国教育部决定授予刘红“全国优秀教师”称号。 |
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