|
作者：检验视界 作者： 李贻林 杨学习 谢冰怡 胡冬梅 基金项目：广州市重点研发计划项目（ 202103000026 ） 作者单位：1.广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东，广州 510515 2. 南方医科大学生物技术学院，广东，广州 510515 3. 南方医科大学珠江医院产科，广东，广州 510515 通讯作者：胡冬梅 [摘 要] 近年来发展起来的宏基因组测序技术，对孕产妇的病原体不明感染性疾病的诊断尤为适用。本文对该技术在妊娠期感染性疾病中的应用，以及关键环节的质量控制进行了归纳总结。 女性怀孕后，更为容易感染各种病原体。而且，感染的早期临床症状和体征易被掩盖，这使得孕产妇感染性疾病的病情进展更快速，更容易发展成更为严重的脓毒症、脓毒性休克、多器官功能衰竭，甚至死亡。除外，妊娠合并感染性疾病还将对胎儿产生不良的影响，是导致胎儿畸形、流产、早产、胎膜早破、死胎、胎儿生长受限等的重要原因。 宫内感染是产科临床上最常见感染类型，许多宫内感染没有任何症状，诊断通常比较困难，往往存在漏诊、且被漏治的宫内感染对孕母及其后代将会产生何种近期或远期的影响尚未可知。 临床上炎症指标，例如白细胞和中性粒细胞数量、降钙素原、白细胞介素-6、C-反应蛋白质虽然对于区分感染和非感染有一定帮助，但正常孕妇也会反映出一定程度的升高。 对于感染性疾病诊治的关键在于查找病原体。目前，临床上用于病原体检测的主要方法为培养的方法、血清学方法、病理检查以及分子生物学方法等。然而，这些方法或多或少地存在出结果时间过长、敏感性不够，假阴性率高、无法直接检出病原体、只能对已知的病原体进行逐个排查，而不能检测未知病原体等弊端。 宏基因组新一代测序技术(metagenomics nextgeneration sequencing, mNGS) 直接提取临床样本中的核酸进行高通量测序，通过生物信息学算法，分析样本中包含的病原微生物种类，运用数据比对软件，可以快速从临床送检样品中准确检出病原微生物 [8] 。宏基因组能够无偏倚地在同一样本中同时检测已知或者未知的所有病原微生物，也就是能同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体等。此外，病原检测的敏感性更高，出报告时间更短，还可以直接分析出样本中的病原体谱、丰度和分布情况，了解潜在病原体的变化情况等，更适用于传统检测结果阴性的感染患者，以及免疫缺陷患者和危重症感染患者的病原体检测 [7] 。 本文通过对mNGS检测优势、实验流程及报告解读规则进行综述，探讨了mNGS在妊娠期感染性疾病中的临床应用价值，从而为mNGS在产科临床的应用提供了更多的理论依据。 实验流程 1.1 样本采集 1.1.1 静脉血标本采集 成人的采血量为4mL。采集的血液推荐存放于有游离 DNA 保护功能的无创专用采血管。 1.1.2 羊水标本采集 如怀疑宫内感染，可采集羊水标本。对于怀疑胎儿感染者，可进行脐静脉穿刺。 1.2 核酸提取 为了提高mNGS的检测灵敏度，可以结合临床检测需求，进行人源核酸的去除。 为提高胞内菌、真菌等的检出率，提取前应对样本进行破壁处理。 1.3 文库构建及上机测序 1.4 生物信息学分析 生信分析方法主要体现在比对方法优化以及下游分析。为了缩短分析时间，提高分析准确性，需要在速度和精度做重点优化，除此之外，在计算资源、能耗、体系结构等方面也存在着优化空间。 1.5 出具报告 报告出具过程中应参考疑似背景微生物库及阴性对照检测结果，尤其是呼吸道定植菌，并结合所提供的临床信息，最终给出检测报告。检测报告应包括检出序列数、平均测序深度、基因/基因组覆盖度和相对丰度等内容。 图3 mNGS实验流程和分析流程 1.6 mNGS 报告解读规则 mNGS可同时检测出样本中的多种微生物，例如细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、衣原体、螺旋体等，但mNGS的阳性阈值受到多种因素的影响，如测序平台、测序流程、测序数据量、样本类型、病原种类、患者病情等。测序平台在三代测序测序片段更长，但是存在一定的测序错误率，造成假阳性，同时二代测序由于测序片段过短，存在亲缘关系比较近的微生物无法区分，造成假阴性，故结合测序平台质控品检测结果进行判定更符合临床真实结果。 讨论 孕妇罹患感染性疾病的病原体有多种，感染性疾病病原体及其药敏的快速鉴定，有助于帮助临床尽快启用敏感的抗生素，迅速缓解症状、改善母儿预后，具有重要的意义[16]。 然而，滞后的细菌培养结果，使得初始治疗一般只能经验性地采用广谱抗生素。这却可能导致耐药基因传播、加剧多重耐药和继发真菌感染。而与培养法相比，分子诊断在病原学检测方面有进一步16S rRNA基因可作为菌种鉴定的分子标记；而基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）能快速准确鉴定细菌、真菌等微生物。 针对mNGS技术应用于妊娠期感染性疾病，发现采样对于结果影响由于重要，故针对不同的妊娠情况采集不同的样本类型；在报告解读中需要临床医生的参与，尽量将mNGS检测到的微生物结合患者的临床症状及其他检测技术的检测结果综合考虑，多学科的综合考虑，能更好的给临床医生提供证据进行诊疗方案的制定。 值得注意的是，虽然mNGS在产科中的作用巨大，但是这种方法还存在检测费用高、医院难以配备这种设备、送检较麻烦、以及过度敏感可能导致的假阳性结果。低丰度微生物的检测在临床中的意义不详、病原体检查结果需要与临床症状、体征以及辅助检查结果结合起来进行综合判定等。 参考文献 [1] 陶冶，孙智晶.孕产妇脓毒症的早期识别与管理［J］.中国实用妇科与产科杂志，2021,37(6)：687-691. [2] Lee YH, Cherkerzian S, et al. Maternal Bacterial Infection During Pregnancy and Offspring Risk of Psychotic Disorders: Variation by Severity of Infection and Offspring Sex. Am J Psychiatry. 2020 Jan 1;177(1):66-75. [3] Noguchi LM, Beigi RH. Treatment of infections during pregnancy: Progress and challenges. Birth Defects Res. 2017 Mar 15;109(5):387-390. [4] 段雅萍, 蔺莉. 宫内感染早期标记物预测价值的研究进展[J]. 中国妇产科临床杂志, 2021, 22(1):3. [5] 龚华, 张建裕, 印永祥,等. 妊娠期弓形虫感染孕妇体内能量代谢变化的临床意义[J]. 实用妇科内分泌电子杂志, 2021, 8(1):4. [6] 李媛媛,李雪梅,朱爱艳,等.妊娠期李斯特菌6例宫内感染的超声诊断及临床分析[J].影像研究与医学应用,2022,6(10):133-135. [7] 许普, 王来栓. 病原微生物宏基因组检测在新生儿感染性疾病中的应用[J]. 中华实用儿科临床杂志, 2020, 35(11):4. [8] 中华医学会儿科学分会新生儿学组,中华儿科杂志编辑委员会.宏基因组二代测序技术在新生儿感染性疾病中的临床应用专家共识[J].中华儿科杂志,2022,60(06):516-521. [9] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome. 2018 Feb 27;6(1):42. [10] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion. Microbiome. 2018 Feb 27;6(1):42. [11] Nelson MT, Pope CE, Marsh RL, et al. Human and Extracellular DNA Depletion for Metagenomic Analysis of Complex Clinical Infection Samples Yields Optimized Viable Microbiome Profiles. Cell Rep. 2019 Feb 19;26(8):2227-2240.e5. [12] Feehery GR, Yigit E, Oyola SO, et al. A method for selectively enriching microbial DNA from contaminating vertebrate host DNA. PLoS One. 2013 Oct 28;8(10):e76096. [13] Song L, Xie K. Engineering CRISPR/Cas9 to mitigate abundant host contamination for 16S rRNA gene-based amplicon sequencing. Microbiome. 2020 Jun 3;8(1):80. [14] 朱韵倩,甘明宇,张丽梅,等.宏基因组二代测序技术对新生儿脓毒症的诊断意义[J].中华新生儿科杂志,2022,37(03):233-237. [15] 张淋,洪城,孟新科,等.宏基因组学第二代测序技术对比传统实验室微生物培养在脓毒症病原学诊断中的优势[J].中国急救医学,2022,42(02):114-120. [16] Filetici N, Van de Velde M, Roofthooft E, et al. Maternal sepsis[J]. Best Pract Res Clin Anaesthesiol, 2022,36(1):165-177. [17] Hussein E F , Ameen J A , Yassen S H . Study the Antibiotics Activity Against Escherichia Coli Isolated from Urine Samples of Pregnant Women with Urinary Tract Infection. IJPR, 2021, 13(1), 1369-1372. [18] Polanunu NFA, Wahyuni S, Hamid F. Seroprevalence and associated risk factors of Toxoplasma gondii infection among pregnant mother in Makassar, Indonesia. PLoS One. 2021 Jun 4;16(6):e0245572. [19] Tioleco N , Silberman A E , Stratigos K , et al. Prenatal maternal infection and risk for autism in offspring: A meta-analysis. Autism Res. 2021 Jun;14(6):1296-1316. [20] Jiang, Juan et al. Metagenomic Next-Generation Sequencing for the Diagnosis of Pneumocystis jirovecii Pneumonia in Non-HIV-Infected Patients: A Retrospective Study. Infect Dis Ther. 2021 Sep;10(3):1733-1745. -End-
排版 | 张宁 审校 | 方研   |
|
|
