【原】【LorMe周刊】互惠互利-细菌间普遍出现交叉喂养现象

LorMe青年 2022-10-20 发布于江苏

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作者：孙天宇，南京农业大学博士在读，主要研究核心链霉菌介导的根际抑病菌群互作与调控机制。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍交叉喂养细菌间常出现的互惠现象，有助于解释不同细菌间代谢合作行为的演化。原文于2022年发表在《ISME Communications》上。

导读

解释细菌间专性合作交叉喂养相互作用的进化源头是一个基本问题。其中，一个关键步骤是两个相互作用成员间出现互惠关系，因为代谢副产物的互利交换会有利于后续合作互养的发生。然而，迄今为止，单向交叉喂养向和双向交叉喂养相互作用转变的倾向性仍然未知。为了解决这个问题，本文系统地将两种细菌的四种氨基酸营养缺陷型与属于25种不同细菌的潜在氨基酸供体共培养。实验结果显示，约40%的处理中营养缺陷型与代谢自主供体在共培养过程中均获得显著生长优势。之后实验表明，引起生长优势的原因并非由引起营养缺陷的突变所导致，而是因为不同物种间通常更倾向于参与协同代谢相互作用。总之，上述发现证明，互惠作用常在单向交叉喂养相互作用中自发出现，并为之后更为紧密的代谢互作的进化打下基础。

主要结果

交叉喂养相互作用的不确定性

越来越多的理论和实验数据表明，细菌常与群落的其他成员交换必需的代谢物。然而，尚不清楚交换的化合物是作为细胞代谢的产物不可避免地释放出来的副产品，还是作为合作行为所产生的，并且这种合作行为是为了对代谢物的受体产生有益的影响而被选择的。产生这种不确定性的主要原因是，确定的生态相互作用是从祖先种群中产生的，通常无法进行验证。此外，使用从环境源中分离出来的菌株进行进化实验通常具有挑战性。因此，在自然微生物群落中，合作交叉喂养相互作用的普遍性仍然不清楚，并且是一个激烈争论的问题。

代谢合作演化的概念模型

解决这一问题的重要一步是确定在受控实验室条件下出现合作交叉喂养相互作用所必需的条件。基于实验证据和理论思考，Pande和Kost提出了一个解释代谢合作演化的概念模型。此模型分析了从自主代谢到两种细菌基因型参与互惠和合作的代谢交叉喂养相互作用的进化过渡。要发生这种转变，细菌细胞需要经过至少四个不同步骤(图1)。最初，细胞释放代谢产物，如维生素或氨基酸，作为不可避免的代谢副产物进入细胞外环境 (图1a)。接下来，某些突变体失去了自主产生并释放某些化合物的能力(图1b)。很多情况下，这些所谓的营养缺陷基因型通过消耗外部可利用的代谢物而获得显著的生长优势，从而与这些代谢物的提供者形成单向交叉喂养的相互作用。此后，最初的单向关系转变为互惠的相互作用(图1c)。最后一步对于互惠合作的后续发展至关重要(图1d)，在这一步中，双方开始积极投入昂贵的资源，以促进对方的发展。在过去几年中，几项实验和计算研究证实了Pande和Kost模型，为许多中间阶段的合理性提供了证据。然而，人们对于从单向交叉喂养相互作用中出现互惠作用的现象却知之甚少。

图1 合作交叉喂养的概念模型

互惠作用出现的可能方式

关于如何实现这一步，有两种可能。首先，供体或受体的突变可能使相互作用对代谢物供体有利。另外，相互作用也可能自发出现，因为供体细胞也受益于它们营养缺陷的相互作用伙伴的某些代谢活动或分泌物。本文的目标是确定互惠作用在代谢物供体和营养缺陷受体之间最初的单向交叉喂养相互作用中自发出现的概率。评估这一步骤是理解互惠合作进化源头的关键，因为理论模型和实验证据都表明，互惠互利的相互作用是互惠合作进化出现的基本前提。通过量化双方在单培养和共培养条件下的生长，作者可以直接评估供体和受体的生长结果，从而确定互惠作用在单向交叉饲养相互作用中自发出现的几率。

单向交叉喂养相互作用的建立

通过将营养缺陷型受体与原营养型供体共培养，建立了单向交叉喂养相互作用。为涵盖广泛的分类多样性，选择了四个细菌门的25个不同物种作为潜在的氨基酸供体。为了最大限度地减少共同进化史可能产生的混淆效应，选择的供体菌株没有从同一环境中分离出来。两种细菌的两种营养缺陷型（即大肠杆菌（EC）和贝氏不动杆菌（AB））作为氨基酸受体。这些突变体无法产生两种氨基酸（即组氨酸（ΔhisD）和色氨酸（ΔtrpB）），因此基本上需要相应氨基酸的外部来源才能生长。利用这些人工合成的相互作用，首先确定了营养缺陷受体在与潜在氨基酸供体共培养中出可检测到生长的处理数。为此，将与氨基酸供体共培养的营养缺陷受体的生长与单培养条件下的生长进行了比较，在单培养条件中，营养缺陷受体是在不提供所需氨基酸的情况下培养的。分析表明，在分析的100个处理中，63%的处理在共培养中发生单向交叉喂养相互作用。在所有情况下，营养缺陷型菌株在24小时内没有生长，因此不再对其进行进一步分析。

05 营养缺陷型菌株对供体菌株生长的影响

接下来，作者定量地确定了营养缺陷型受体的存在如何影响供体的生长。与前面的分析类似，将共培养供体种群的增长与单培养条件下的增长进行比较。然而，这一次只纳入了受体受益于供体的那些处理。该分析显示，在25%的实验组合中，供体的生长受到营养缺陷基因型的负面影响(图2)。这一结果与代谢物交叉喂养相关的结论一致。例如，供体细胞在单独培养时可能会向细胞外部环境释放代谢物，但在生长后期又会消耗这些营养物质。然而，持续消耗氨基酸的营养缺陷菌株的存在可能会阻止释放的代谢物的再吸收。在所有处理中，35%的处理在共培养和单培养条件下的供体生长没有观察到显著差异，表明这些是不影响供体生长的中性相互作用。这种中性效应可能表明，供体没有利用营养缺陷型菌株产生的代谢物，可能因为对相应化合物的需求量低，或者在给定的实验条件下无法吸收。又或者，生长抑制效应可以抵消营养缺陷型菌株的生长促进效应。令人惊讶的是，40%的供体在与营养缺陷型受体配对时获得了显著的生长优势（图2）。

图2 供体菌株常受益于营养缺陷型菌株

物种影响互惠作用强度

为了进一步了解在上述实验中决定互惠关系自发出现的规则。作者探究营养缺陷型受体增强或抑制共培养供体的趋势是否取决于双方的系统发育关系。在供体细胞与营养缺陷型菌株共培养时出现生长抑制的情况下，未检测到这种现象。有趣的是，在供体受益于营养缺陷菌株的情况下，研究发现供体和受体之间的系统发育距离和两种组氨酸供体基因型的增长之间存在显著的负相关。然而，在营养缺陷型菌株内，未检测到这种现象。总之，该实验表明，单向交叉喂养相互作用通常会导致自发出现互惠相互作用，这种作用的强度取决于营养缺陷型突变体所属的物种，而不是营养缺陷型突变的特性。

07 影响供体生长优势的因素

作为营养缺陷受体的两个物种是否都能观察到自发的互惠现象？如果是，营养缺陷表型本身是否导致了这种模式？为了回答这些问题，作者将这两种物种的原营养型和营养缺陷型分别与随机选择的供体物种进行共培养，这些供体物种在与营养缺陷型受体共培养时在生长方面受益。在这些条件下，几乎所有的供体物种在所有测试组合中相对于其单一培养对照均获得了显著的生长优势。唯一的例外是包含原野生型大肠杆菌的共培养处理组，在该情况下，供体生长与单培养对照无显著差异。然而，供体经历的生长优势取决于共培养群体的基因型，具体取决于物种：对于贝氏不动杆菌，相对于与相应营养缺陷基因型共培养的贝氏不动杆菌野生型(WT)细胞，存在原营养细胞的情况下供体生长显著增强（图3）相比之下，大肠杆菌营养缺陷型和原营养型对共培养供体的促生长作用没有显著差异（图3）。因此，该实验证实，单向交叉喂养交互作用中普遍存在的供体生长优势可能不是由于调控变化引起的，而是由于共培养物种的特性引起的，调控变化是由营养缺陷的突变引起的。

最后，作者探究了供体微生物在共培养实验中所表现的物种特异性生长优势是否是由于营养缺陷受体释放到细胞外环境的代谢物所导致。为了解决这个问题，作者收集了所有四种营养不良菌株以及相应野生类型的上清液。并提供给供体细胞进行单独培养。随后，通过将24 h后的种群密度量化为600 nm光密度来确定供体细胞的生长情况。分析结果表明，上清液中的代谢物不能解释之前观察到的氨基酸供体的生长优势。在所有处理中，补充受体上清液的处理均未使供体菌株的生长高于未补充对照的水平。而在添加受体培养物上清液的条件下，这两个物种的营养缺陷菌株以及原野生型大肠杆菌的生长明显不如未添加条件下的好。这些观察表明，仅从营养缺陷受体释放代谢物不能解释供体的生长情况。相反，在实验设置中没有考虑到的其他参数也可能发挥作用。