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结果：MS患者NA（正常皮质）皮质的ICV_f在两种D//值下均明显低于健康对照(FDR P<0.001)。MS患者的CLs（病变皮质）中ICV_f和ODI均显著低于NA (FDR-p≤0.008)。与RRMS相比，PMS患者NA的ICV_f和ODI显著降低(FDR-p=0.050和FDR-p=0.032，仅D//=1.7µm2/ms)。MS临床表型间CL的显微结构无明显差异。MS-NA的ICV_f和ODI与病程、临床损害、病变、全脑和局部脑萎缩显著相关(r=-0.51~0.71，FDR-p<0.001~0.045)。 总结：MS患者的正常皮质有明显的神经突起丢失。CLs显示轴突密度进一步降低，ODI减少，表明轴突的复杂性简化。NODDI指标与影响MS皮质的异质性病理有关。本文发表在Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry杂志。 引言炎症和脱髓鞘通过确定脊椎、轴突和神经元变性而导致多发性硬化症(MS)的灰质(GM)损伤，影响不可逆转的临床损害和认知障碍。临床上皮质损害与MS相关，因此迫切需要针对皮质病理过程的生物标志物来更好地了解皮质损害的病理生理机制及其与临床表现的关系。 磁共振成像是活体检测与多发性硬化症相关的皮质异常的理想工具。利用磁共振成像，研究表明从疾病开始，局灶性皮质病变(CLs)和萎缩在进行性多发性硬化症(PMS)中普遍存在，并可能是与更严重临床表现相关的预测因子。然而，CL评估不能发现影响皮质的所有病理过程，而皮质萎缩反映的是终末期神经轴突丢失。 弥散张量成像(DT)MRI已被用于表征MS正常皮质(NA)和CLs的病理基础及与临床相关性。值得注意的是，与健康对照组(HCs)相比，MS患者的正常皮质表现为分数各向异性(FA)降低和平均弥散系数(MD)增加，CLs的特征是与NA皮质相比，FA增加。然而，DTI固有的方法局限性使其在GM中的解释具有挑战性，缺乏对单一病理基础的特异性。 神经轴突定向弥散和密度成像(NODDI)是一种弥散加权(DW)多壳磁共振成像技术，用于更好地模拟活体内大脑微观结构的复杂性。NODDI可以克服DTI的局限性，并提供更具体的组织微观结构测量。具体地说，NODDI模拟了水在三个微观结构中的扩散，即细胞内和细胞外，以及自由各向同性高斯扩散。此外，NODDI还提供方向分散指数(ODI)表征轴突定向可变性。 少数研究将NODDI应用于MS。一项MRI和组织病理学相结合的研究表明，NODDI测量反映了轴突的丢失并评估组织的连贯性。其他研究主要集中在对白质(WM)病变和正常白质(NAWM)或脊髓损害的评估，WM和NAWM的细胞内体积分数(ICV_f)(或轴突密度指数)均降低HC，但ODI异常不均匀。 目前，使用NODDI对GM NA异常研究发现了相互矛盾的结果，一些研究发现MS患者GM NA的ICV_f显著低于HC，同时CLs的ICV_f低于NA皮质，但另一些研究尚未证实。关于ODI的研究结果不一，在一些研究中，与HC相比，MS患者GM的ODI减少，而在另一些研究中则没有。以前的大多数研究评估了一小部分MS患者，没有覆盖整个疾病过程，也没有具体评估皮质或CLs的存在。此外，不理想的序列分辨率可能会阻碍大脑皮质的准确研究，可能会产生WM和脑脊液(CSF)的部分容积效应。最近的一项对91例MS患者的评估表明，与MS患者和HC的NA皮质相比，CLs的ICV_f更低。然而，与复发-缓解型多发性硬化患者(RRMS)相比，MS患者仅在部分NA皮质区域的ICV_f显著低于HC和PMS患者，ODI没有进行调查。此外，最近研究还关注NODDI分析的平行扩散系数(D//)值。因此，在更大的患者队列和不同D//值应用于NODDI是必要的，以更好地在活体内区分MS的皮质损害，并证明NODDI的临床相关性。在这项研究中，在相对大队列的MS患者中使用NODDI探究NA皮质和CLs的微观结构异常及其与疾病表型和临床损害的关系。 材料与方法研究人群在2017年4月至2020年11月期间，连续评估了172名多发性硬化症患者（MS）。多发性硬化症纳入标准为：根据2017年修订的麦克唐纳标准诊断，在进入研究前至少1个月无复发和无类固醇，没有其他重大的神经或精神疾病，并从至少6个月开始对多发性硬化症进行稳定治疗。62例HC包含在内，无神经系统疾病或可能影响中枢神经系统的全身性疾病，且神经学检查完全正常。 在MRI获得后的3天内，由一位不了解MRI表现情况的经验丰富的神经科医生进行神经学检查，并进行扩展残疾状况量表评分(EDSS)。 MRI采集使用3T Philips Ingenia CX扫描仪(Philips Medical Systems)和被试定位的标准化程序，获得大脑MRI序列(接收线圈=ds-Head-32)： (1)矢状3D液体衰减反转恢复(FLAIR)，FOV =256×256 mm，voxel size =1×1×1 mm，192层，matrix=256×256，TR=4800ms，TE=268ms，TI=1650ms，ETL=167，TA=6.15min； (2)矢状3D双反转恢复(DIR)，FOV=256 mm，voxel size=1.2×1.2×1.3 mm，195层，matrix=214×214，TR=5500ms，TE=254，TI=1650/2550ms，ETL=173，TA=6.5min； (3)矢状3D T1加权梯度回波序列，FOV=256×256，voxel size =1×1×1 mm，204层，matrix=256×256，TR=7ms，TE=3.2ms，TI=1000ms，翻转角=8°，TA=8.53min； (4)轴向脉冲梯度自旋回波DW回波平面成像；同时多层成像=2；沿6/30/60非共线方向采集三个b=700/1000/2850 s/mm2；采集了10个 b=0 s/mm2，并沿采集过程进行了分布；以独立的序列采集三个用于失真校正的反转梯度 b=0 s/mm2；FOV=240×233 mm，voxel size=2.3×2.3×2.3 mm，56层，matrix=112×85，TR=5900ms，TE=78ms，翻转角=90°，TA=10min。对于所有扫描，扫描层位置平行于一条线连接最下方的前缘和后缘的最下方，并在随访时仔细重新定位。 常规MRI分析及CLs量化使用3D FLAIR和3D T1加权像作为输入图像，通过全自动化和经验识别局灶性T2-高信号的WM病变。在仔细检查自动分割的结果后，从每个患者的病变mask中获得T2-高信号WM病灶体积(LV)。 基于已发表的建议和伪影排除，根据DIR计算并量化CLs (图1A和补充材料)。由两个经验丰富的评分者协商一致完成在DIR上手动检测CLs，并使用局部阈值分割技术估计CLs (Jim V.8.0 software, www.xinapse.com)。CLs量化仅局限于皮质而不累积皮质下WM(皮质下白质，即I型、II型和IV型)和WM/GM混合型病变(I型)且皮质区主要延伸(>50%)。 使用FSL SIENAx软件对3D-T1加权图像进行全脑、GM、皮质和WM的分割及其归一化的计算(图1B)。有关更多详细信息，请参阅补充材料。  (A)根据已发表的指南(橙色箭头)在DIR序列上识别CLs。 (B)使用FSL SIENAx软件(蓝色)在矢状面3D T1加权序列上分割灰质。 (C)NA皮质(蓝色)和CL(绿色)的ICV_f及其量化。 (D)ODI及其在NA (蓝色)和CL(绿色)的量化。 DW MRI分析NODDI分析NODDI分析中，扩散信号的模型包括三个部分：细胞内（指的是各向异性非高斯扩散），细胞外（各向异性高斯扩散），以及脑脊液或脑水肿中遇到的自由各向同性高斯扩散。 纤维定向弥散考虑Watson分布，适用于GM和WM中的纤维和轴突建模。模型的未知量是Watson分布的离散度和细胞内、CSF体积，由此可以得出细胞外的体积分数。使用NODDI Toolbox估计参数图和默认参数。 然而，D//在WM和GM之间有所不同。为了估计NODDI参数，设置D//为1.7µm2/ms，这个值使用胼胝体作为参考固定下来。将D//设置为1.2µm2/ms进行NODDI估计，该值是最小化大脑GM的模型残差而建议的值的范围。（文章在两个D//参数进行了分析，1.7和1.2都有）。 我们计算了ICV_f，该值表示在膜过程中的有界空间。它通常被认为是神经突起贡献的一种衡量标准，尽管神经胶质突起也应该包括在内。此外，我们估计了ODI（模拟纤维的分散和细胞过程的分散指数），从而量化组织的方向一致性和结构完整性。 DT-MRI测量和NODDI的量化NODDI的ICV_f和ODI， DT的FA和MD在NA和CLs的平均。为此，使用线性配准将皮质GM和病变的mask转换到扩散空间(图1C，D和补充材料)。使用0.5的阈值并使用GM模板控制范围后，病变区域被放大向外延伸：向皮质外围放射状延伸；这接近WM像素，特别是WM/GM混合病变，可能会偏向FA的增加，它通常接近GM/WM时更高。 统计分析采用χ2检验、Mann-Whitney U检验或双样本t检验比较MS与HCs、以及MS亚组间的人口学、临床及常规磁共振信息。T2高信号的WM LV和CL值在分析前进行对数转换。 通过DT MRI和NODDI测量，线性混合效应对HC-NA、MS-NA和MS-CLs之间进行比较，考虑了分层数据结构(hierarchical data structure)。使用广义线性模型对HCs、RRMS和PMS患者的DT MRI和NODDI测量的NA皮质和CLs。所有分析将年龄和性别作为协变量。另外还进行了包括治疗×临床表型的交互作用分析，以测试疾病疗法在不同临床表型中的可能效果。 使用偏相关性来评估临床、常规、DT MRI和根据年龄和性别调整后的NODDI之间的相关性。 考虑到比较和相关性的总次数，进行FDR校正。 P <0.05被认为具有统计学意义。采用SPSS V.26.0软件进行统计检验。 结果人口学、临床和常规MRI表现与HC相比，MS的T2-高信号WM LV显著升高(p<0.001)，较低的正常脑容量(NBV, p<0.001)，正常灰质体积(NGMV, p=0.001)，正常皮质体积(p=0.01)，正常白质体积(NWMV, p<0.001)(表1)。 与RRMS患者相比，PMS患者年龄更大、病程长、EDSS评分和T2高信号LV更高、较低的NBV、NGMV、正常皮质体积和NWMV(P<0.001)(表1)。 表 1 HC及多发性硬化症患者的主要人口学、临床和常规MRI特征及其临床表型
多发性硬化症患者广泛的CLs117例(68%)MS患者至少有一种CL。与RPMS相比，PMS出现至少一种CL的比例更高(62/71，87% vs 55/101，55%；p<0.001)(表1；补充材料)。与RRMS患者相比，PMS患者的CL中位数更高(5 (IQR=2~9) vs 1 (IQR=0~4)，p<0.001)和CL体积(0.12mL (IQR=0.05~0.29)VS 0.02mL (IQR=0.00~0.11)，p<0.001)。 DTI和NODDI在不同皮质组织的结果与HC-NA相比，MS-NA具有更高的MD (FDR-p<0.001)和更低的ICV_f(FDR-p<0.001，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms)(表2和图2)。 与HC-NA皮质相比，MS-CLs具有更高的FA(FDR-p<0.001)，以及更低的ICV_f(FDR-p<0.001，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms)和ODI(FDR-p<0.001，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms)(表2和图2)。 与NA皮质相比，MS患者的CLs具有更高的FA(FDR-p<0.001)和更低的MD(FDR-p=0.016)、ICV_f(FDR-p=0.006和<0.001，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms)和ODI(FDR-p <0.001，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms)(表2和图2)。 表 2 HC NA与MS NA与CLs的DT MRI及NODDI测量比较
 图 2 DTI和NODDI测量的组间差异。箱图显示组间差异：HC (浅蓝色圆圈)、MS NA (橙色三角形)和CLs(红色正方形)。 (A)FA(左)和MD(右)； (B)ICV_f，D//设置为1.7µm2/ms (默认，左)或1.2µm2/ms (优化参数，右侧)； (C)ODI，D//设置为1.7µm2/ms (默认，左)或1.2µm2/ms (优化参数，右侧)。 基于多发性硬化症临床表型的DT MRI和NODDI发现
 相关分析MS患者NA的MD与年龄、病程、EDSS、T2高信号的WM LV和CL呈正相关(r=0.27-0.56，FDR-p≤0.002)，与正常大脑、GM、皮质和WM体积呈负相关(r=−0.46-−0.77，FDR-p<0.001)。NA皮质ICV_f与年龄、病程、EDSS、T2高信号WMLV和CL体积呈负相关(r=−0.23-−0.51，FDR-p≤0.004)，与整体和局部体积呈正相关(r=0.27-0.71，FDR-p≤0.001)，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms (表4和图4)。最后，NA（正常皮层）的ODI与年龄、EDSS、T2高信号WM LV和CL体积呈负相关(r=−0.18-−0.46，FDR-p≤0.045)，与整体和局部体积正相关(r=0.17-0.54，FDR-p≤0.045)，D//设置为1.7µm2/ms和1.2µm2/ms (表4和图4)。NA的FA仅与年龄(r=0.28，FDR-p=0.001)和病程(r=−0.18，FDR-p=0.045)显著相关。CLs的微观结构特征与常规磁共振测量之间的相关性有限，包括T2-高信号WM-LV(D//为1.2µm2/ms的CL ODI：r=−0.23，FDR-p=0.045)和局部测量(r=−0.28-0.33，FDR-p≤0.02)(表4)。 表 4 多发性硬化患者中NA和CLs的DT MRI和NODI测量与临床、常规MRI测量的相关性
 图 4 相关分析。 散点图显示了NA的ICV_f(D//设置为1.7µm2/ms (默认，蓝色圆圈)或1.2µm2/ms (优化参数，浅蓝色三角形)，和ODI(D//设置为1.7µm2/ms (默认，绿色菱形)或1.2µm2/ms (针对皮质优化，橙色十字))与临床和常规MRI测量之间的相关性。 连续线：具有统计学意义的相关性；虚线：无统计学意义的相关性。有关更多详细信息，请参阅文本。 讨论通过分析大队列MS患者的NODDI，我们发现，与HC相比，MS患者NA的ICV_f和ODI降低，且在PMS患者中更为明显，并与更长的病程、更严重的病情和结构脑损伤显著相关。与NA皮质相比，CLs的ICV_f和ODI进一步降低。 与之前研究结果一致，在D//为1.7和1.2µm2/ms时，MS-NA（正常皮质）的ICV_f显著低于HC，在PMS和RRMS中也是如此（D//设置为默认参数）。值得注意的是，其他研究发现MS患者和HC的NA之间没有全局ICV_f差异，或者只在有限皮质区域显示ICV_f显著降低（MS vs HC，PMS vs RRMS）。和我们研究相比，除了MRI采集和分析的不同之外，之前的研究纳入较少的早期RRMS，以及MS患者损害程度低，因此皮质异常有限，可以解释这些相互矛盾的发现。 此外，我们还发现，与MS患者和HC的NA皮质相比，CLs的ICV_f显著降低。由于ICV_f与轴突密度相关，活体MRI研究表明，MS皮质有明显的轴突丢失，CLs更为严重，也累积未受局灶性脱髓鞘影响的皮质。虽然小胶质细胞突起(如小胶质细胞、星形胶质细胞等)也包括在ICV_f中，但对解释发现的贡献有限，因为最近的病理学研究表明，小胶质细胞和星形胶质细胞在NA皮质和CLs中的分布没有显著差异。 在MS和HC中，CLs的ODI也低于NA皮质。而在MS患者亚组中，MS NA的ODI显著低于HC，特别是在PMS患者中。以前研究报告了不同的GM-ODI结果，MS患者显示GM的ODI减少，或者不同GM区域发现与HC相反的变化。ODI的减少可能意味着径向和切向轴突分布的变化，以及树突复杂性的降低。显然，小胶质细胞和星形胶质细胞突起的简化有助于解释NA和CLs中ODI的减少。然而，ODI与轴突方向的变异性显著相关，而与小胶质细胞和星形胶质细胞的数量无关，表明ODI可能主要是由于轴突方向复杂性的变化。 值得注意的是，DT MRI分析证实，与HC NA皮质相比，MS NA皮质的MD也显著增加，与HC NA和MS NA皮质相比，CLs的FA显著增加，与MS NA皮质相比MD降低。 我们的发现与大量的病理学研究相一致，这些研究表明在MS NA皮质以及更广泛的CLs中存在异质性神经退行性变过程，包括轴突、树突和突触的丢失。 此外，我们的结果提示MS皮质中的轴突丢失和树突复杂性减弱，这与MS尸检结果以及通过NODDI研究婴儿大脑成熟、正常成年人和神经退行性疾病的皮质细胞结构的结果保持一致。 有趣的是，在早产儿和不同胎龄期间，从早产儿到足月获得的MRI检查发现，ODI显著增加。这些结果表明，皮质的逐渐成熟可能代表了ODI变化的机制，从神经元和神经突起的分布到更复杂的树突分支、突触发芽和传入纤维的发育。 在成熟皮质中，神经突起主要沿径向或切向皮质轴线排列。最近对505个HC的研究表明，ICV_f和ODI的区域异质性反映了皮层的细胞结构，在初级体感、视觉和听觉皮质中具有较高的值。这些区域的特点是大量的神经突起，其中许多包括在Baillarger的有髓纤维。 在MS皮质中发现的结果可能反映了神经退化现象，即与成熟大脑相反的神经突起以及树突的丧失。这一假设也在神经退行性疾病得到支持。阿尔茨海默病患者的ICV_f和ODI在双侧颞叶降低，累积在主要受疾病影响的脑区，NODDI测量与tau病理负担之间存在负相关。 以前的DT MRI研究一直表明，皮质的特征是由径向轴突促进各向异性扩散，在脑发育过程中，树突的成熟仍未完成时皮质的扩散程度更高。此外，MS皮质之间的FA异质性可能是NA和CLs中径向和切向轴突的不同丢失所致。 因此，我们可以推测，在疾病的最早阶段，轴突的丢失和树突的简化可能主要局限于CLs，可能继发于局灶性病变，导致更有限的神经轴突损害。在整个疾病过程中，轴突逐渐丢失和组织简化也涉及到NA，与病程和EDSS评分呈负相关。与此相一致的是，RRMS患者NA的ICV_f和ODI显著降低，在PMS患者中更为严重。有趣的是，只有在D//为默认参数时，NA的ICV_f和ODI的降低能区分PMS和RRMS。 与体积萎缩的相关性研究也表明，作为不可逆组织丢失的替代测量，NODDI测量可能对轴突丢失更具特异性。 与T2高信号WM-LV的显著相关性表明，MS NA的NODDI异常可能是由于由这些轴突组成的WM局灶性病变导致的退变和径向轴突丢失所致。CL病变和NODDI测量之间的显著相关性表明，NA损害也可能继发于局灶性皮质脱髓鞘，并在病程中逐渐积累。 我们的研究有一定的局限性。虽然我们使用3D DIR来识别CLs，但与7T T2*加权成像相比，3D DIR只能检测到少数的CLs。特别是，软脑膜下病变更有可能被忽略。因此，一些未被发现的CLs可能与本研究中发现的NA皮质异常有关。MRI扫描是通过为每个序列优化像素大小来获得的。因此，图像被重新采样到扩散分辨率，不允许更详细的皮质分割。我们用cross- sectional评估了整个皮质。NODDI可以在MS CLs中检测到显著的全局皮质微观结构异常和更严重损害，这一证明支持NODDI在体内研究MS相关损害的病理学特异性和相关性。显然，不同大脑皮质的细胞结构是极其不同的，MS皮质损害可能以不同的模式发生。因此，未来的研究应该评估基于NODDI的CLs和NA异常分布区域差异，以及与病变分布、临床损害和认知功能障碍的关系。对大队列多发性硬化症患者的评估和NODDI评估以及后续的核磁共振扫描可以揭示多发性硬化症患者皮质损伤累积的进展及其临床意义。 由于不同的皮质区域具有特定的细胞结构特征，而且MS可能影响具有时空异质性的不同脑区，未来的研究需要更好地在区域水平和纵向水平下研究NODDI异常，以及这可能有助于MS进展研究。最后，最近有人对使用NODDI一些假设的有效性提出了疑问，这些假设基于GM可能是有偏见的。由于D//设置为默认参数在GM中已被证明是次优的，我们也使用较低的D//(1.2 µm2/ms)估计了NODDI测量，正如最近建议的那样，以优化GM的NODDI估计。有趣的是，这两种分析的结果相似，从而证实我们的发现。提供这种约束的一种替代方案增加了获取和计算复杂性，降低了NODDI在临床环境中的可行性。目前，没有明确的迹象表明如何在临床环境中继续使用NODDI的可行性，但正如最近所建议的那样，NODDI可能会提供有关不同情况下发生在GM中的不同病理过程的相关信息，包括MS。 综上所述，MS患者的NA皮质特征是显著的轴突丢失和皮质细胞结构复杂性的简化，这与临床相关，并与更严重的结构脑损伤显著相关。CLs显示出更严重的轴突丢失，同时复杂性降低。NODDI是一种可靠和临床相关的方法，可以在体内研究影响MS皮质的异质性神经退行性变化过程。 |
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