仲景炮附子对慢性心力衰竭的治疗作用及机制研究

慢性心力衰竭（CHF）是心功能不全的一种类型，临床表现为乏力、呼吸困难、心悸、下肢水肿等综合病症，是造成心脏病患者死亡的最主要原因之一，死亡率高达50%以上［1］。中医治疗CHF历史悠久，根据其临床表现，CHF可归属于“心悸”“喘证”“水肿”“心水”“痰饮”等范畴［2］。中医认为CHF的病机关键在于心气阳虚［3］，因此古今中医名家常用温通心阳之法治疗心阳虚。

附子为温阳圣药，具有回阳救逆、补火助阳之功，被誉为“回阳救逆第一品药”，治病保命“药中四维”［4］。现代研究表明，附子具有显著的强心作用［5-10］，是治疗CHF方剂中使用频率最高的前10位中药之一［11］。仲景炮附子是《伤寒论》中的特色饮片，在《伤寒论》中张仲景用干热法“炮”附子以制其毒，长于温经扶阳、温阳制水，为补命门真火之要药，常用来治疗心衰、阳虚等症［12］。课题组前期研究中模拟仲景炮附子与《中国药典》2020年版附子饮片进行比较，发现仲景炮附子中虽仍保留有一定量的毒性成分双酯型生物碱，但符合药典的限量规定，达到了减毒的效果；同时药效成分单酯型生物碱和水溶性生物碱含量远高于药典附子饮片［13-14］。

目前，关于附子治疗CHF的研究多集中于药典收载的黑顺片、炮附片，含附子的药对，以及含附子的方剂［15-20］，未见关于仲景炮附子治疗CHF的研究报道。因此，本实验采用阿霉素构建大鼠CHF模型，通过观察大鼠症状体征和心肌病理组织切片，检测血清脑钠素（BNP）含量，心肌细胞Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶活性，研究仲景炮附子对CHF的治疗作用。此外，目前未见对仲景炮附子成分鉴定的报道，故采用超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱（UPLC-QE-Orbitrap-MS）对仲景炮附子中的化学成分进行表征，以全面分析其化学组成，并结合网络药理学探究仲景炮附子抗CHF的作用靶点及分子机制，为进一步深入研究提供参考依据。

仲景炮附子水煎液对CHF大鼠的影响

(1)造模后心功能及血清BNP水平检测

与对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD均有降低趋势，EF、FS均显著降低（P＜0.05）；血清BNP水平显著升高（P＜0.01），结果见图1。表明大鼠CHF模型制备成功。

(2)一般观察

对照组大鼠呼吸状况、精神状态、活动情况正常；模型组大鼠出现稀便、腹水、体质量减轻等现象，造模结束时因心衰死亡1只；仲景炮附子水煎液组大鼠稀便情况得到一定程度改善，腹水和体型消瘦情况改善不明显。

(3)BNP水平

给药16 d后，仲景炮附子水煎液对大鼠BNP水平的影响结果见图2。模型组与对照组相比，BNP水平显著升高（P＜0.01）；仲景炮附子水煎液组与模型组相比，BNP水平显著降低（P＜0.05），表明仲景炮附子水煎液可显著降低CHF大鼠的BNP水平。

(4)Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶活力

如图2所示，模型组与对照组相比，Ca2+-ATP酶、Na+，K+-ATP酶活力均有降低趋势；仲景炮附子水煎液组与模型组相比，Ca2+-ATP酶、Na+，K+-ATP酶活力均有升高趋势，表明仲景炮附子水煎液对CHF大鼠心肌组织能量代谢有一定的改善作用。

(5)心肌组织病理变化

如图3所示，模型组大鼠左心室心肌组织切片较对照组出现明显的心肌纤维断裂，心肌间隙增宽，出现部分空泡变性等病理变化；仲景炮附子水煎液组与模型组相比，心肌组织断裂减少，间隙变窄，空泡减少，表明仲景炮附子水煎液可明显改善CHF大鼠心肌组织的损伤。

仲景炮附子水煎液化学成分鉴定

在ESI正离子电离模式下，仲景炮附子总离子流图见图4，成分鉴定结果见表1。

基于网络药理学的仲景炮附子抗CHF机制研究

(1)仲景炮附子成分靶点获取

在Pubchem中搜索52个化学成分的SMILES文件，通过Similarity ensemble approach（SEA）和Swiss Target Prediction预测靶标，根据筛选标准，共得到靶标1 348个，去重后得到仲景炮附子成分靶点472个。

(2)CHF靶点获取

在Genecards数据库中获取得到“chronic heart failure”下靶标10 845个，筛选“inflammation”项下“relevance score”大于20的靶基因，得到569个；TTD数据库中共获取靶点10个；OMIM数据库获取靶点548个；DrugBank数据库获取靶点12个；汇总共得1 139个，去重后得到“chronic heart failure”的相关靶点1 063个。

(3)仲景炮附子与CHF共有靶点的获取

将获取的仲景炮附子成分靶点和CHF疾病靶点进行映射比对，得到68个药物与疾病共有靶点，见图5。

(4)构建“药物-成分-疾病-靶点”网络

仲景炮附子治疗CHF的“药物-成分-疾病-靶点”交集网络见图6，其结果表明仲景炮附子水煎液有43个成分参与调控CHF的分子网络。

(5)PPI网络构建与分析结果

将获得的68个靶标导入STRING数据库后，设置隐藏游离点，最低互动得分要求中选择highest confidence（0.900）。PPI网络图见图7。导出TSV格式的作用关系结果文件，将文件导入Cytoscape 3.8.0软件进行可视化分析，剔除网络中没有作用关系的单个节点，网络共计50个节点，202条边。利用“Analyze Network”功能，获取到“degree”（数值2～38），大于10的有13个，见图8。“degree”从小到大，节点显示从小到大，颜色从橙色至红色。

在“cytoHubba”模块，依次用介度中心性（betweeness）、接近中心性（closeness）、度中心性（degree centrality）预测关键靶点，选择前13位的基因，其交集为信号转导与转录激活子3（STAT3）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（PIK3CA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、蛋白酪氨酸激酶2（JAK2）、蛋白激酶B（AKT1）、MAPK14、CREB结合蛋白基因（CREBBP）、MAP2K1，故推测这些基因为仲景炮附子治疗CHF的关键靶点。

(6)GO功能富集分析

利用R语言对仲景炮附子对CHF潜在作用靶点进行GO功能富集分析，以P＜0.05为筛选条件，共获得89个MF，72个CC，2 012个BP。根据校正P值由小到大排序，确定了排名前10条BP相关的GO条目，涉及丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调节、上皮细胞增殖、调节血液循环、MAP激酶活性的调控等；排名前10条MF相关GO条目，包括酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、生长因子结合、血红素结合等；排名前10条CC相关GO条目，依次为膜筏、膜微区、膜区、神经元胞体等。体现了化合物可能调控多个复杂的生物学过程来发挥多种药理作用，将富集结果按显著性排序进行展示，见图9。图中横坐标表示富集在条目上的基因数，纵坐标表示条目名称。颜色越红，代表显著性越大。

(7)KEGG通路富集分析

利用R语言对仲景炮附子对CHF潜在作用靶点进行KEGG通路富集分析，获得75个KEGG通路。根据P值由小到大，排名前20的通路涉及RAS相关蛋白1（Rap1）信号通路、钙信号通路、磷脂酰肌醇3'-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信号通路、MAPK信号通路、内分泌抵抗、Ras信号通路等。将富集结果按显著性排序进行展示，见图10。图中横坐标代表富集在通路上的基因数，纵坐标代表通路名称。颜色越红，代表显著性越大。

讨论

CHF是由多种复杂病因诱发的心肌损伤以及结构和功能的改变，主要表现为心肌收缩能力减弱，EF下降，最终导致心室泵血功能低下［23］。CHF在中医上属于本虚标实证，以心、肾阳气亏虚为本，以水、痰、浊、湿、瘀为标，中医采用整体观念的辨证思维，以治病求本为治则，运用温阳扶正祛邪法对于CHF的治疗起到了积极的作用［24］。附子是中医临床不可缺少的常用药之一，大辛大热，具有回阳救逆之功效，以温阳扶正法改善心功能［25］，被誉为乱世之良将，回阳救逆之第一品。仲景炮附子来源于医圣张仲景的《伤寒论》，为治疗心衰经典方真武汤的君药。

BNP是心室肌细胞合成和分泌释放的多肽物质，是诊断CHF的重要指标［26］，能够准确反映心肌细胞承受的压力大小，BNP水平和CHF具有高度相关性［27］，与CHF的程度呈正相关［28］。Hejl等［29］研究发现，BNP水平与CHF全因死亡率密切相关，患者的存活率随着BNP水平的增加而降低，并随着年龄和性别调整，BNP每增加1倍，死亡率增加32.3%。CHF患者心肌组织病理变化常表现为心肌细胞排列紊乱，细胞间隙明显增宽，心肌纤维溶解断裂等［30］。与对照组相比，CHF模型组大鼠BNP水平显著升高，心肌组织出现明显的心肌纤维断裂、空泡，且心肌间隙增宽。仲景炮附子水煎液给药后可显著降低CHF大鼠的血清BNP水平，减小心肌组织纤维间的断裂、细胞间隙和空泡，降低其心力衰竭程度。

另外，心脏作为高耗能的器官，对于能量的供给至关重要。能量代谢的改变是导致CHF发病的重要环节之一，Ca2+-ATP酶、Na+，K+-ATP酶活力与心肌细胞能量代谢的过程密切相关［31］，与对照组相比，模型组Ca2+-ATP酶、Na+，K+-ATP酶活力降低，提示心肌能量产生障碍，仲景炮附子水煎液可在一定程度上提高Ca2+-ATP酶、Na+，K+-ATP酶活力，表明其参与调节心肌细胞能量代谢过程，对心肌组织的能量代谢具有一定改善作用。

本实验通过网络药理学预测仲景炮附子治疗CHF的关键靶点可能是STAT3、PIK3CA、MAPK1、JAK2、AKT1、MAPK14等，对关键靶点进行KEGG通路富集分析探究其在信号通路中的作用，发现仲景炮附子可能通过钙信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等发挥抗CHF的作用。钙离子是细胞内的第二信使，在心肌细胞动作电位的形成和兴奋-收缩偶联中起着不可或缺的作用，心肌细胞内钙离子的动态平衡可以保证细胞舒张功能正常进行，维持心肌细胞基因表达和正常结构［32］。

PI3K-Akt信号通路是调节心脏功能的重要通路，在心肌细胞生长代谢过程中起着重要作用，通路中的众多受体和激酶与心力衰竭有着密切的联系。PI3K-Akt通路的适度激活可以抑制心肌细胞凋亡，缓解心肌细胞的纤维化，抑制心室重构，平衡心肌能量代谢，从而改善心功能［33］。研究发现，PI3K-Akt信号通路的激活可抑制心衰大鼠心脏的纤维化，改善其心室肥厚［34］，抑制心脏组织炎症和氧化应激［35］。

MAPK是一类广泛存在于体内大多数细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对心肌细胞的分化、凋亡、增殖及炎症反应起着重要的调节作用。MAPK家族有4个主要分支，分别为细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38/MAPK）和细胞外信号调节激酶5（ERK5）。相关研究表明［36］，重度心衰病人p38/MAPK激活会导致心肌细胞凋亡坏死，加重心衰；抑制心肌细胞中p38/MAPK活性，可显著减少心肌缺血和再灌注导致的损伤，减少心肌细胞凋亡［37］。

心力衰竭并非简单的心肌泵送功能缺陷，而是影响许多器官、系统的复杂全身炎症疾病［38］。CHF患者以全身炎症为特征，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1、IL-6、IL-8等炎症因子会随心力衰竭严重程度加深而升高［39-42］，这些因子会介导多种炎症递质的分泌和释放，继而加重炎症反应，导致血管内皮功能下降，微循环障碍，损伤心肌细胞，加快心肌细胞的坏死、凋亡，引起心肌纤维化和重塑等病理变化，进而加重心衰。

PI3K-Akt通路、MAPK信号通路等均对心肌细胞的炎症反应起着调节作用，过度激活的PI3K-AKT信号转导通路会增强促炎因子TNF-α产生和释放，进而导致细胞因子的失衡，引起炎症反症［43］；MAPK信号通路是经典的炎症通路之一［44］，p38/MAPK、JNK、ERK等作为重要的炎症调控因子，其激活后进入细胞核调控多种转录因子的表达，从而促进炎症细胞的浸润与活化，加剧心衰。研究表明，当心肌细胞损伤时，降低p38浓度水平能够有效控制心肌细胞炎症反应引起的心肌重塑［45］。

本研究通过体内实验证明仲景炮附子对CHF有治疗作用，可以降低CHF大鼠血清BNP水平，改善其心肌组织病理性损伤，改善心肌组织的能量代谢。使用网络药理学对仲景炮附子治疗CHF的关键靶基因及信号通路进行分析预测，初步揭示了仲景炮附子通过PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、钙信号通路、Rap1信号通路等来调节血液循环、调节丝氨酸/苏氨酸激酶活性、调节上皮细胞增殖、调控MAP激酶活性等进而治疗CHF，为探明仲景炮附子治疗CHF的作用机制提供一定的理论基础。但本研究未将仲景炮附子与药典附子饮片进行比较，存在一定的局限性。而且中药成分复杂，治疗疾病的机制复杂，为进一步探明仲景炮附子治疗CHF的作用机制，还需要进一步的实验加以佐证。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：焦鸣杰，李欣欣，刘淑明，陈倩，陈冬玲，尹贻慧，张凯，魏龙吟，张佳，李飞．仲景炮附子对慢性心力衰竭的治疗作用及机制研究 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(10):1980 -1991 .