【原】发现正常眼压青光眼发病的治疗靶点 -视网膜星形胶质细胞功能异常导致正常眼压性青光眼-

发现正常眼压青光眼发病的治疗靶点 -视网膜星形胶质细胞功能异常导致正常眼压性青光眼-

概要

　

山梨大学研究生院综合研究部医学域药理学讲座小泉修一教授以及筱崎阳一副教授的研究小组发现了与至今为止不明原因的正常眼压青光眼的发病相关的分子。 该研究是与伦敦大学( UCL )眼科学研究所的罗恩·亚历克斯先生(研究生)以及大沼信一教授的国际共同研究。 此外，东京都医学综合研究所参事研究员原田高幸、生理学研究所超微形态研究部门/自治医科大学解剖学讲座大野伸彦教授、新潟大学研究生院医齿学综合研究科脑功能形态学领域竹林浩秀教授、山梨大学研究生院综合研究部眼科学讲座柏木贤治教授、该学综合分析实验中心讲师濑川高弘讲师、社会医学讲座三宅邦夫副教授等给予了协助。 青光眼曾被认为是因眼压异常升高而发病的疾病，但实际上已知眼压在正常范围内的所谓“正常眼压青光眼[1]”的患者数量占绝大多数。 研究小组从以全世界的青光眼患者为对象的被称为GWAS[2]的基因变异分析的数据库中，发现了“ATP-binding cassette transporter a1 ( abca1) [3]”的异常，开始了关注这个分子的分析。 通过使用小鼠的实验，发现ABCA1存在于视网膜和视神经周围存在的被称为"神经胶质细胞[4] "的细胞群中的"星形胶质细胞[5] "，发现了如果这个ABCA1的功能受损的话，尽管眼压正常，视网膜的神经细胞也会受到伤害，引起正常眼压青光眼样的症状。另外，通过“1细胞RNA测序[6]”进行的分析表明，星形胶质细胞会产生“趋化因子[7]”，具有谷氨酸受体亚型“NR3A[8]”的神经细胞会选择性地受到伤害 这些是世界上首次显示星形胶质细胞有可能成为青光眼新的治疗靶点的成果。 本研究成果将刊登在美国科学振兴协会( AAAS )发行的开放存取杂志Science Advances上。

论文信息

论文标题 astrocytic dysfunction induced by abca1deficiency causes optic neuropathy 作者 #Youichi Shinozaki，#Alex Leung，Kazuhiko Namekata，Sei Saitoh，Huy Bang Nguyen，Akiko Takeda，Yosuke Danjo，Yosuke M Morizawa Fumikazu Sano、Nozomu Yoshioka、Hirohide Takebayashi、Nobuhiko Ohno、Takahiro Segawa、Kunio Miyake、Kenji Kashiwagi、takayuki Harada, Shin-ichi Ohnuma*, and Schuichi Koizumi*#共同笔头作者、*责任作者 刊登的杂志 Science Advances杂志 [刊登于2022年11月5日3点(日本时间)/2022年11月4日(美国东部时间) ] DOI: 10.1126/sciadv.abq1081

背景

　青光眼是日本中途失明原因第一的疾病。 据说患病率在40岁以上约为5%，其比例随着年龄的增长会进一步上升。 青光眼中的失明被认为是由将视觉信息传递到大脑的视网膜神经节细胞( RGC )的障碍引起的。 眼压是青光眼发病的最大风险因素之一。 认为由于眼压上升，视神经容易受到伤害。 因此，作为延缓青光眼发展的治疗，会采取降低眼压的处理。 虽然已有多种降低眼压的滴眼药用于治疗，但除了单一药剂有时效果不充分、药剂效果有时会逐渐减弱、即使充分降低眼压，症状也会发展之外，还存在各种各样的副作用等问题。 另外，日本人的青光眼患者大多相当于眼压为正常值的正常眼压青光眼，因此寻找眼压以外的新治疗目标成为了紧迫的课题。 青光眼是由年龄、人种、吸烟、高血压、糖尿病、家族史等各种危险因素影响的多因素疾病。 作为危险因素之一，有遗传因素。 GWAS是一项调查遗传因素和疾病发病难易程度的研究，研究表明，ABCA1基因的单核苷酸多态性与青光眼发病风险相关。 因此，我们推测ABCA1可能以某种形式与青光眼发病相关，但①ABCA1功能缺失或功能异常获得哪个更重要，②作为青光眼风险最常见的影响眼压，③ABCA1在眼睛的哪个细胞中表达，有助于青光眼，其机理几乎不明确。

研究成果

　

研究小组首先对ABCA1功能的缺失或异常功能的获得，哪一个与青光眼发病相关进行了研究。 为了明确这一点，我们使用全身性缺失ABCA1的小鼠( ABCA1KO小鼠)，调查了其对RGC的影响。 结果发现，与正常小鼠(野生型小鼠)相比，在ABCA1KO小鼠的视网膜中，12个月龄时RGC的数量显著减少(图1A )。 另外，对引起细胞死亡的细胞进行标识后发现，与野生型小鼠相比，在ABCA1KO小鼠的视网膜中，引起细胞死亡的RGC数明显增加(图1B )。 然后，评估ABCA1KO小鼠的眼压是否发生变化，与野生型小鼠的眼压相比没有明显的上升(图2 )。 根据这些结果，认为ABCA1的功能缺损有可能独立于眼压的上升而参与青光眼发病。 接下来，研究小组使用各种方法评估了ABCA1在哪个细胞表达。 结果发现ABCA1在分布于视网膜最内层及视神经的非神经细胞胶质细胞之一的星形胶质细胞中丰富表达(图3 )。 制作缺失星形胶质细胞表达的ABCA1的小鼠( AstroKO )进行评价时，AstroKO小鼠在12个月龄时与对照小鼠( Ctr )相比，RGC数明显减少(图4A )，死细胞数增加(图4A ) 此外，与Ctr小鼠相比，AstroKO小鼠的眼压没有显著升高(图5 )。 根据这些结果，研究小组认为AstroKO小鼠可能会表现出正常青光眼的症状，并对表征青光眼的解剖学和功能所见进行了评价。 12个月龄的AstroKO小鼠与野生型小鼠相比，表现出明显的视网膜内层变薄(图6A )，多局部网电图的视觉应答明显减弱(图6B )。 以上结果表明，AstroKO小鼠表现出正常眼压青光眼样的症状。 为了进一步揭示分子机制，研究小组进行了单细胞RNA测序分析(图7A )。 结果发现，被称为趋化因子的分子在RGC和星形胶质细胞中共有变化(图7B、7C )。 从视网膜内的表达来看，例如CXC l12 (激活CXC R4的趋化因子)在星形胶质细胞中表达，其在AstroKO小鼠中显著增加(图7D )。 另一方面，从RGC的详细分析中，发现特定的细胞集团特别容易受到伤害。 根据单细胞分析，RGC可以分为两个亚群(图8A )。 有趣的是，发现缺失ABCA1时，只有命名为RGC-1的亚群特异性减少(图8B )。 详细分析RGC-1的基因表达变化发现，离子通道型谷氨酸受体亚基之一的grin 3a (编码nr3a的基因)的表达在ABCA1缺失中大幅减少(图8C )。 NR3A能抑制谷氨酸引起的神经兴奋，一般认为其表达降低会因过度的神经兴奋和兴奋毒性导致神经细胞死亡。

今后的发展

这次的结果通过实验证明了世界上首次存在于视网膜和视神经中的星形胶质细胞有可能成为青光眼，特别是正常眼压青光眼的发病原因。 到目前为止，降低眼压的治疗药物备受关注，但作为新的治疗目标，我们发现了星形胶质细胞。 今后，控制星形胶质细胞功能的新青光眼治疗药物的开发备受期待。 本研究由文部科学省的科学研究费补助金学术变革领域研究( a )、基础研究( a )、国际共同研究强化( a )、基础研究( b )、基础研究( c )、挑战性研究(开拓)、研究据点形成事业、尖端生物成像支持平台( ABiS )、山梨GLIA中心研究资助、公益财团法人武田科学振兴财团、老年人眼病研究财团以及第一三共生命科学研究振兴财团支持进行。

图1. ABCA1KO小鼠RGC脱落和细胞死亡

( a )测量12个月龄小鼠视网膜的RGC数时，与野生型小鼠相比，ABCA1KO小鼠的RGC数显著减少( **显示显著差异)。 ( b )另一方面，用检测细胞死亡的染色进行评价时，在ABCA1KO中发生细胞死亡的细胞数量明显增加。

图2. ABCA1KO不影响眼压

比较了3个月龄及12个月龄的野生型和ABCA1KO小鼠的眼压，认为两者在任何月龄下都没有明显差异，ABCA1的缺失对眼压没有大的影响。

图3. ABCA1在视网膜星形胶质细胞中表达

( a )将视网膜的细胞分为微胶质细胞、星形胶质细胞、其他(神经细胞和血管等)，评价了Abca1基因在各个组分中的表达量，结果表明在星形胶质细胞组分中的表达比其他组分高3.5倍左右。 ( b )免疫组织化学染色法评价ABCA1在小鼠视网膜切片中的表达，发现神经纤维层有较强的信号，内网状层和外网状层有较弱的信号。 由于强信号与在星形胶质细胞高表达的蛋白质共定位，因此发现ABCA1主要在星形胶质细胞表达。 ( c )明确了这样的表达模式在人视网膜切片中也同样，在神经纤维层~神经节细胞层强烈表达，主要在星形胶质细胞中表达。

图4. AstroKO小鼠RGC脱落和细胞死亡

缺失星形胶质细胞ABCA1的小鼠( AstroKO )与对照(正常表达Ctr、ABCA1)小鼠相比，( a ) RGC的细胞数明显减少，( b )死亡细胞数增加。

图5 .缺失星形胶质细胞ABCA1不影响眼压

比较3个月龄及12个月龄对照与AstroKO小鼠的眼压，认为两者在任何月龄下均无显著差异，星形胶质细胞中ABCA1的缺失对眼压无明显影响。

图6. AstroKO小鼠表现为青光眼样症状

( a )麻醉条件下用光学相干断层仪观察视网膜断层图像，12个月龄的AstroKO小鼠与同月龄的Ctr小鼠相比，出现了视网膜内层(神经纤维层~内网状层)变薄。 ( b )为了评价视觉功能，用多局部视网膜电图测量了对视觉输入的电响应，Abca1KO小鼠的响应明显减弱。

图7. 1细胞RNA序列分析

(( a ) 1细胞RNA测序的结果，可以分离成各个细胞集团，对每个细胞种类进行了详细的分析。 ( b )在星形胶质细胞以及RGC中被发现有变动的基因组中，大多数是共通的。 ( c )发现趋化因子受体CXCR4 signaling pathway在星形胶质细胞和RGC中表达共同增加。 ( d )调查了CXCR4的配体CXCL12的表达模式，发现其局限于星形胶质细胞进行表达，在AstroKO小鼠中表达进一步增加。

图8 .部分RGC亚型易受青光眼影响

( a ) 1细胞RNA测序结果表明，RGC可以分为两个亚簇。 ( b )特别是在RGC-1中，细胞数随着ABCA1缺失而特异性减少。 ( c )在RGC-1中，ABCA1缺失导致grin 3a (编码nr3a的基因)表达显著减少。

图9 .本研究成果总结

( a )星形胶质细胞ABCA1缺失引起的青光眼样症状。 AstroKO小鼠眼压无变化，但12个月龄出现RGC脱落、视网膜变薄、轴突障碍和视觉功能障碍等正常眼压性青光眼症状。 ( b )星形胶质细胞ABCA1缺失导致青光眼发病的分子机制。 缺失ABCA1会导致星形胶质细胞内胆固醇堆积，由此导致的细胞功能障碍会诱导星形胶质细胞产生趋化因子( CXCL12和CCL5等)。 RGC亚型高表达NR3A，ABCA1缺失会降低NR3A的表达。 据推测，这将导致谷氨酸的信号过剩，产生兴奋毒性，诱导RGC的细胞死亡。

用語説明

[1]正常眼压性青光眼

 青光眼是一种被称为视网膜神经节细胞( RGC )的视网膜神经细胞受到伤害而导致视野逐渐缺损的疾病。 眼压上升是最广为人知的风险因素之一，但在亚洲人，特别是日本人，即使是青光眼患者，很多人的眼压也会控制在正常范围内，从这一点来看，眼压以外的因素有可能是该病的原因。 [2]基因组宽相关分析( GWAS ) 我们的基因由DNA的碱基序列( a、t、c、g )的组合编码，但即使是编码同一基因的序列，碱基的一小部分也可能因人而异。 这称为单核苷酸多态性( SNPs )，GWAS是一种在覆盖整个基因组的广阔区域中检测SNPs频率，并在统计学上调查该频率与疾病的相关性的方法。 通过该分析，推测特定基因与疾病风险的关系。 [3] ATP-binding cassette transporter ( abca1) 是被称为ABC转运体的膜蛋白之一。 利用ATP的能量将各种化合物向细胞膜内外输送。 ABCA1将游离脂肪酸和胆固醇等脂质运输到细胞外，传递给载脂蛋白e等。 ABCA1还调节吞噬作用、饮食作用、免疫细胞功能、开口释放、细胞内信号转导、抗炎作用等多种功能。 [4]小胶质细胞 是构成大脑等中枢神经系统的细胞的一种。 在人类，数量比神经细胞更丰富。 神经胶质细胞不像神经细胞那样表现出电生理上的兴奋性，所以一直被认为是静态的、不活动的细胞，但从近年来的研究中可以看出是非常活跃的细胞。 小胶质细胞包括星形胶质细胞、微胶质细胞、少突胶质细胞等。 [5]星形胶质细胞 是小胶质细胞的一种。 是最大、数量最多的细胞种类。 一直以来被认为起到支持大脑和维持稳态的作用，但最近也明确了积极参与大脑的信息处理。 星形胶质细胞也存在于视网膜的最内层表面和视神经周围。 在视网膜实质内，也存在着与星形胶质细胞相似的缪勒细胞。 [6] 1细胞RNA测序 1细胞RNA序列是将视网膜等组织内的细胞一个个分离出来，对这些单个细胞保持的信使RNA的状态和量进行全面调查的方法。 将获得的量的信息数字化，通过信息学的分析(生物信息学)，可以客观且全面地分析医学生物学机制。 [7]趋化因子 趋化因子是一种叫做细胞因子的细胞间信息传递物质，是碱性蛋白质。 会引起白细胞等的迁移，引起炎症。 [8] NR3A NR3A是构成N-甲基-D-天冬氨酸( NMDA )受体的一种亚单位。 NMDA受体由NR1和NR2或NR3亚基组成，形成离子通道。 在生物体内谷氨酸结合活化。 NR3也称为消极型，它能抑制离子通道的活性。

*研究小组

 
山梨大学 大学院総合研究部 医学域 基礎医学系 薬理学講座/GLIAセンター
教授 小泉 修一 (責任著者)
准教授 篠崎 陽一 (共同筆頭著者)
大学院生 武田 明子
学部生 檀上 洋右
大学院生 森澤 陽介 (現 米国コロンビア大学ポスドク)
助教 佐野 史和
准教授 繁冨 英治

英国ロンドン大学 眼科学研究所 脳科学研究部門
教授 大沼 信一 (共同責任著者)
大学院生 ルング アレックス (共同筆頭著者)

東京都医学総合研究所 視覚病態プロジェクト
参事研究員　原田 高幸
副参事研究員 行方 和彦

生理学研究所 超微形態研究部門/自治医科大学 医学部 組織学部門
教授 大野 伸彦
研究員 グェン フイ バン
特任助教 齋藤 成 (現 藤田医科大学 医学部 解剖学II 講師)

新潟大学大学院 医歯学総合研究科 脳機能形態学分野
教授 竹林 浩秀
助教 吉岡 望

山梨大学 大学院総合研究部 医学域 臨床医学系 眼科学講座
教授 柏木 賢治

山梨大学 大学院総合研究部 総合分析実験センター
講師 瀬川 高弘

山梨大学 大学院総合研究部 医学域 基礎医学系 社会医学講座
准教授 三宅 邦夫

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