今天来策下如何准确制备细胞周期测试的样品,真的是百试百灵哦! 简单介绍下实验原理 碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,可以与 DNA 和 RNA 结合,但其不能透过正常的细胞膜,所以对活细胞无染色作用。可通过冷乙醇或其他破膜剂的作用,使细胞膜通透性增加。 PI 进入细胞内后,选择性地与核酸结合,RNase 裂解 RNA 后,细胞内染料的荧光量与细胞核内的 DNA 含量成正比。 通过流式细胞仪检测单个细胞荧光强度得到相对 DNA 含量,根据各个时相 DNA 含量不同,将细胞分为不同的周期。 具体操作流程及注意事项 1、将对数期的细胞接种于 6 孔板中(2×105 个 / 孔,根据细胞大小、增值速度适当调整),每孔加 2 ml 培养基培养。 2、细胞贴壁后(根据细胞具体情况),去除培养基,分别加入培养基配置的不同浓度药物 1 ml 孵育(不使用造成细胞大量死亡的药物浓度和孵育时间)。 3、药物作用结束后,收集培养液,1500 rpm,离心 4 min。一定要一并收集漂浮的死细胞,不然会严重影响结果。 4、消化收取贴壁细胞,吹打过程一应要轻柔充分,避免细胞受损、细胞黏连;离心转速为 2000 rpm,离心 4 min(离心转速不要超过 2000 rpm,也可以采用 1000 rpm,离心 5 min),PBS 洗 3 遍,以去除培养基、药物残留及细胞碎片。合并培养液和贴壁细胞。 5、细胞沉淀中加入少量 PBS,轻柔充分重悬细胞。然后将重悬的细胞加入到 4℃预冷的 70%冰乙醇中固定,轻轻吹打均匀(切记!!!不要将冰乙醇加入到细胞中,这样会造成细胞黏连,严重影响结果),封口膜封口,4℃过夜。 6、2000 rpm 离心 4 min,吸去固定液,PBS 洗两次,以去除固定液。 7、细胞中加入含 PI(50 μg/ml)、RNaseA(50 μg/ml,去除 RNA)和曲拉通(1%,通透细胞膜)的工作液 200 μl(曲拉通粘性大,配置时一定要涡旋,保证混合均匀),室温避光孵育 30 min。按照步骤 1 中的铺板细胞数,这个体积的工作液可以保证测试时的细胞浓度正合适。 8、流式细胞仪检测细胞周期。染色后,可以使用 PBS 去除染液,也可选择不处理,亲测没有影响。 9、FlowJo 软件分析细胞周期时相分布。 注意!注意!!注意!!!
今天就策到这里,下次告诉大家 FlowJo 软件分析细胞周期相分布时的注意事项,因为作者发现有 SCI 文章的流式周期分布图,明显是造假出来的,哈哈哈哈…… 图片来源:作者提供 |
|