FISH在淋巴瘤诊断中的应用

淋巴瘤是中国常见的恶性肿瘤之一。2020年中国新发霍奇金淋巴瘤6829例，死亡2807例；新发非霍奇金淋巴瘤92834例，死亡54351例。淋巴瘤病理类型复杂，异质性强，治疗原则各有不同。近年来，随着人们对淋巴瘤本质认识的不断深入，淋巴瘤在诊断和治疗方面出现了很多新的研究结果，患者生存得到了改善。淋巴瘤中经常发生一些染色体的畸变，如断裂、融合，导致基因表达异常；而这些异常可以使用荧光原位杂交技术（FISH）进行检测。淋巴瘤中重现性的细胞遗传学异常很多，其中大部分可以用来辅助淋巴瘤诊断（表1）。如MYC-IGH融合基因常发生在伯基特淋巴瘤，BCL2-IGH融合常发生在滤泡性淋巴瘤。慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤中常出现13q缺失（约55%）、11q缺失（12%-18%）、17p缺失（5%-10%）；其中11q和17p缺失与ATM、TP53基因缺失和功能失去有关。还会出现获得性的异常，如12号染色体三体（约15%）；这些变异与临床的特征非常密切，可使用FISH方法来判断预后。预后差的比较为del（17p）＞del（11q）＞trisomy12＞正常FISH结果＞isolated del（13q）。MAF-IGH、FGFR3-IGH融合探针应用在多发性骨髓瘤中较多。

表1 淋巴瘤常见的细胞遗传学异常

讲座中还从探针类型进行了介绍，并进行案例分享。

01

基因分离探针（染色体易位）

分离探针的设计将异常基因断裂位点两端分别标记为红色和绿色，若基因未发生断裂重排，则表现为两个融合信号（阴性）；若基因发生断裂重排，则表现为一红一绿一融合（典型阳性信号）。王哲教授介绍可以使用三通滤镜观察细胞核内出现的单色信号（红色/绿色），判断是否产生信号分离。淋巴瘤中常用的分离探针包括MYC、BCL2、BCL6、CCND1断裂探针，主要用于诊断Burkitt淋巴瘤，双打击淋巴瘤和套细胞淋巴瘤；其中BCL2断裂探针可用于辅助诊断滤泡性淋巴瘤。

Burkitt淋巴瘤的病理诊断思路

病例1

男性，63岁右颈部淋巴结肿大，HE形态以一致的中等大小的细胞为主，并非典型的弥漫大B细胞淋巴瘤，核分裂多，有一定异形。初步判断为不典型Burkitt淋巴瘤以及不典型弥漫大B细胞淋巴瘤。免疫组化表现CD20（+）、CD10（+），判断为生发中心来源的，BCL6（-）、MUM1（-）、Ki67（+）、BCL2（强阳）、MYC阳性（＞70%）。

王哲教授提示，虽然以上指标也有一些在Burkitt淋巴瘤中表达，但是综合来看并不是Burkitt淋巴瘤，更像是双打击的弥漫大B细胞淋巴瘤。使用FISH探针检测后发现，MYC断裂探针为阳性，BCL2断裂探针为阳性；由此整体诊断为双打击淋巴瘤。诊断为高级别B细胞淋巴瘤，伴有MYC、BCL2基因重排。

双打击大B细胞淋巴瘤最初在Burkitt淋巴瘤中发现，常见MYC、BCL2、BCL6基因易位，其中MYC+BCL2 DH常表现为GCB表型，MYC+BCL6 DH常为ABC表型，若MYC+BCL2+BCL6则为三打击淋巴瘤，是预后差的表现。而该类淋巴瘤还可发生于TdT+B淋巴母细胞瘤（偶见）、浆母细胞淋巴瘤（罕见）、低级别滤泡性淋巴瘤（罕见），都与预后差相关。如果MYC的转位配对基因为免疫球蛋白(如IGH、IGK、IGL等),也是提示预后差的表现。

病例2

间变型弥漫大B细胞淋巴瘤

病例形态特征为弥漫出现间变细胞/在弥漫大B的背景下出现至少10%的间变细胞。免疫组化与FISH表现见图1。其中细胞遗传学表现除了经典的断裂以外，还会出现MYC/BCL2/BCL6的基因多拷贝。王哲教授提示大家注意，在分离探针的应用中，不仅要关注断裂，对于基因的多拷贝状态也是关注的重点。文献资料中对于非典型的DH-DLBCL的一种新观点：MYC与BCL2/BCL6同时出现多拷贝（大于4 copies/cell），P53免疫组化阳性（＞50%），同时MYC基因断裂，提示预后和治疗反应较差。

图1  间变型弥漫大B细胞淋巴瘤

病例3 

样本形态特征表现为大的紧密排列的膨胀性滤泡，主要由中心母细胞和中等大的母细胞组成，圆形或者卵圆形细胞核，染色质为细颗粒状，核仁小，胞浆少，有时可出现星空现象。免疫组化和FISH表现：MUM1（+）、BCL2（+）（63%）、CD10（+）、BCL6（+）。分子检测发现，无BCL2/IGH基因转位，有IRF4基因断裂。以上表现也可能发生于IRF4转位的大B细胞淋巴瘤，预后都很好。诊断为咽淋巴环儿童型DLBCL。

由于IRF4断裂探针的设计上DUSP22与IRF4两个基因挨得很近，故DUSP22基因异常也可以使用IRF4断裂探针来检测，可应用在ALK阴性的间变大细胞淋巴瘤，该类淋巴瘤也会伴有TP63重排（8%），该重排预后最差。

02

基因融合探针

融合探针是基于已知融合基因来设计的，将融合伙伴基因分别标记为红色和绿色，若两个基因未发生融合，则表现两对分离的红绿信号（阴性）；若两个基因发生融合，则表现为一红一绿两融合（典型阳性信号）。融合基因存在的线索：不仅有信号融合而且有每个核信号数量的增加。

【融合与分离探针的对比】

优点：能识别融合的两个基因，能识别罕见的癌基因近端有小插入的病例（分离探针可能会漏掉）

缺点：不如分离探针用途广；由于信号数量多，切片信号截断导致判读困难。

病例4

患者为男性，34岁，左锁骨上淋巴结肿大1月。形态特征：结节状病灶，主要以大细胞为主，散在小细胞。免疫组化：CD20（弥漫阳性）、CD3（少阳）、Ki67（+）、BCL6（+）、CD10（-）、CD21（（+）、MUM1（-）、BCL2（+）以上支持滤泡性淋巴瘤，Cyclin D1（生发中心很多小细胞阳性）、CD5（散在阳性）、CD43（+）。临床诊断时认为可能是滤泡性淋巴瘤？或套细胞淋巴瘤？使用FISH探针进行补充检测，发现CCNG1-IGH融合（-），BCL2-IGH融合（-）。双染：BCL-2+Cyclin D1（+）。最终诊断：复合性套细胞淋巴瘤/滤泡性淋巴瘤IIIb，伴有混合特征。

患者经过5周期CHOP治疗，PR；8个月后死于脑膜受累；可见预后很差。

值得注意的是在融合探针中也会出现单信号小簇以及多拷贝数增加。

病例5

患者为女性，背部疼痛逐渐加重2月，双下肢瘫痪10天，CT显示11th-12th胸椎占位，椎骨破坏。形态特征：大量典型浆细胞弥漫分布，细胞大，出现大量红色结晶；免疫组化：CD138（+）、CD38（弱阳）、MUM-1（+）、Ki67（+）、Lamda（+）、Kappa（-）。以上诊断为浆细胞瘤伴有Crystalstoring histiocytosis（晶体储积性组织细胞增多症）。使用FISH探针检测FGFR3-IGH融合（+）。最终诊断：高级别浆细胞瘤伴有IGH-FGFR3融合，同时有晶体储积性组织细胞增多症，预后差。

专题最后的总结中，王教授强调，FISH技术通过对细胞遗传学异常的检测，在淋巴瘤的诊断，预后的判断、特殊类型的发现有很大的帮助。

以上卫星会提到的探针类型以及效果图如下：

 左：BCL2-IGH       右：BLC2拷贝数增加

 左：BCL2阳性       右：CCND1-IGH

 左：MYC阳性       右：MYC-IGH

 左：IRF4       右：FGFR3-IGH

 淋巴瘤探针的应用情况