Nature子刊：揭示人源葡萄糖转运子SGLT1的抑制机制

子孙满堂康复师 2022-11-22 发布于黑龙江

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钠-葡萄糖共转运蛋白（SGLT）是人体中负责葡萄糖重吸收的重要转运蛋白，能够利用钠离子的电化学势进行葡萄糖的逆浓度梯度转运¹。在人体中的SGLT蛋白家族中，SGLT1和SGLT2两个蛋白对葡萄糖的吸收和稳态最为关键。其中，SGLT1由SLC5A1基因编码，主要在小肠和肾脏近曲小管S3节段表达⁴，负责肠道中食物来源的葡萄糖及原尿中残余葡萄糖的重吸收，并且还有水通道的功能⁵。SGLT1的失活突变会导致肠道葡萄糖-半乳糖吸收不良症¹；SGLT2由SLC5A2基因编码，主要在肾脏近曲小管S1和S2节段表达，负责原尿中90%的葡萄糖重吸收²，SGLT2的失活突变会导致家族性肾尿糖^2,3。

作为II型糖尿病治疗的重要靶点，利用SGLT2抑制剂来治疗糖尿病的思路就是通过抑制SGLT2的糖转运功能，使得SGLT2无法从原尿中重吸收葡萄糖，导致多余的葡萄糖从尿液中排出以达到间接降低血糖的目的。已经有很多SGLT2抑制剂如恩格列净（Empagliflozin）、卡格列净（Canagliflozin）、达格列净（Dapagliflozin）⁶等小分子药物被研发出来用于临床治疗II型糖尿病。此外，最近的临床试验表明，与单独使用SGLT2抑制剂相比，同时抑制SGLT1和SGLT2在治疗II型糖尿病中可能会更有优势⁷，并且靶向SGLT1的抑制剂还有治疗便秘的效果⁸。

SGLT的抑制剂均是以天然产物根皮苷的结构为基础优化产生，根据它们的选择性可以将这些抑制剂分为三类：SGLT2特异性抑制剂，如恩格列净（Empagliflozin），卡格列净（Canagliflozin），达格列净（Dapagliflozin）等；SGLT1特异性抑制剂，如KGA-2727，mizagliflozin以及SGLT1-SGLT2非选择性抑制剂，如LX2761，索格列净（sotagliflozin）等。因此，了解这些药物是如何抑制SGLT的功能对于药物开发和优化具有重要意义。

2021年12月，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心陈雷研究员研究组在Nature杂志首次报道了人源SGLT2-MAP17复合物与抑制剂恩格列净结合的结构⁹，同时，美国斯坦福大学冯亮课题组也在同期杂志上发表了人源SGLT1无配体结合状态的向内开口的结构¹⁰。但是SGLT1与抑制剂结合的模式，以及某些SGLT1特异性抑制剂的选择性机制仍然是未知的。

陈雷研究组在Nature Communications杂志发表了题为“Structural mechanism of SGLT1 inhibitors”的研究论文，该研究通过单颗粒冷冻电镜解析了人源SGLT1-MAP17复合物与抑制剂LX2761结合的高分辨结构。

图1. SGLT1与MAP17相互作用及hSGLT1-MAP17复合体的电子密度图

SGLT1与SGLT2的分子量接近，序列相似性较高，单独解析SGLT1蛋白的结构具有一定的挑战性。作者发现SGLT1与SGLT2的TM13上与MAP17相互作用的氨基酸高度一致，推测SGLT1可能也可以与MAP17形成复合体。随后，这个猜想得到了实验的证实。在此基础上，作者利用了在解析SGLT2结构中发明的“三接头策略”来进行SGLT1结构的解析：作者将GFP融合在SGLT1的胞内区，将GFP纳米抗体融合在MAP17胞内端¹¹，获得了具有功能同时又适合冷冻电镜研究的蛋白。作者通过冷冻电镜单颗粒分析方法解析了人源SGLT1-MAP17复合体与抑制剂LX2761结合状态的高分辨率结构（图1）。

通过结构比较发现，SGLT1与SGLT2的结构十分相似，具有相似的结构特征和拓扑特征。与无配体结合状态的SGLT1不同，抑制剂LX2761将SGLT1锁定在向外开放的构象（图2）。LX2761的糖基头部结合在SGLT1的底物结合位点，通过疏水相互作用与底物结合位点的氨基酸相互作用，长链尾巴向外延伸，阻塞胞外区的通道入口。作者将SGLT1的L274和D454分别突变为丙氨酸发现，突变的SGLT2降低了和抑制剂的结合，减弱了抑制剂的抑制作用。

图2. 抑制剂LX2761的结合位点

为了解释SGLT1特异性抑制剂mizagliflozin的选择性机制，作者将SGLT1和SGLT2的抑制剂结合口袋进行了比较，发现在SGLT1中的结合口袋要略大于SGLT2，而这一差异来源于SGLT1第160位氨基酸的差异：SGLT1第160位丙氨酸对应于SGLT2的第157位缬氨酸。作者通过分子动力学模拟对mizagliflozin与SGLT1的结合模式进行了模拟，并将模拟结果与SGLT2的结构进行了比对。结果发现，由于LX2761的中央苯环基团被mizagliflozin的异丙基吡唑基取代，在SGLT2的V157位氨基酸处形成了空间冲突，这可能导致了mizagliflozin对SGLT2的效力降低。因此，作者分别构建了SGLT1的A160V和SGLT2的V157A突变体，发现在SGLT1中将A突变为V会降低mizagliflozin的效力，而在SGLT2中将V突变为A则会提高mizagliflozin的效力。因此，作者鉴定了SGLT1的A160为影响Mizagliflozin选择性的主要位点之一。

同时，由于SGLT1也可以作为水通道发挥作用，作者也对抑制状态下的SGLT1结构进行了水通道的计算，结果发现在被抑制剂抑制的状态下，SGLT1中的水通道也被LX2761所阻塞，其通道大小无法通过水分子。

结合先前发表的无配体结合状态的SGLT1的结构，作者也将向内开放的SGLT1与向外开放的SGLT1结构进行了比对，描绘了SGLT1在开放和关闭状态之间的构象变化。其中，作者发现有些螺旋的位置基本不发生变化，即TM1，2，6，7，11，12，13，作者把这些螺旋命名为恒定模块（constant module）；其他螺旋则发生较大的构象变化，包括TM0，3，4，5，8，9，10，这些螺旋被命名为运动模块（moving module）。其中，TM10上F453的运动介导了胞外门控的开放，TM3上的Y290介导了胞内门控的开放。

综上所述，作者通过冷冻电镜对SGLT1-MAP17复合物和抑制剂的结构进行解析，发现抑制剂将SGLT1锁定在向外开放状态，确定了SGLT1抑制剂的结合位点和结合模式，在一定程度上解释了SGLT1选择性抑制剂的机制，为进一步优化SGLT1和SGLT2特异性抑制剂提供了结构基础。