近年来大热的宏基因组测序技术不仅在肠道菌群与健康领域发热发光，在病原微生物检测方面的应用也发展迅速。在面对未知病原或有重要临床意义的样本时，采用宏基因组技术开展筛查（又被称为mNGS）已成为很多家医院或者疾控的常规选项。然而在我们欣喜的看到该技术的迅速发展以及日益落地的同时，也必须认识到，mNGS技术仍未完全的成熟，特别是在结果解读方面仍需要专业的判断，需因事因时因人，结合技术、应用场景、其他实验结果综合判断。在这方面，由于技术路线和分析方法的繁杂，目前国内仍未形成金标准，但今天笔者想和大家分享一篇2020年发表于中华检验医学杂志的专家共识，其中对于很多共性问题进行了解读，很有参考意义。
《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识》-中华检验医学杂志https://rs./CN114452202012/1304134.htm该文章所有权利归作者和中华检验医学杂志所有，笔者仅根据个人体会摘取部分要点（加黑或下划线部分为要点，括号灰色部分为笔者解读部分）与各位分享~目前病原微生物的确认依然遵循Koch法则，即：（1）该微生物存在于同类疾病患者中，健康个体则无此微生物。（2）该微生物必须能够被分离、培养、纯化。（3）该微生物接种于易感动物可引起相同疾病，并可从被接种的动物体内分离到此微生物。（4）该微生物可引起每一个个体发病［25］。但是，作为一种临床检验方法，利用mNGS确认的感染病例并不能够完全满足传统Koch法则，作为该法则的补充，mNGS具有如下特征。1. mNGS结果分析：理论上，凡存在于标本中的微生物均可检出，但因不同类型微生物基因组长度和测序平台等差异，导致无法针对所有微生物建立统一的阴阳性判读标准［7， 26, 27, 28］。实验室应根据预期用途、标本类型、检测目标和技术特点，建立并验证阳性阈值及判读标准。原则上mNGS的临床意义同核酸检测。另外，决定一个序列是否来自于某种微生物，很大程度上取决于用于比较的参考微生物序列数据库，如果数据库中未包括该物种以及与其进化距离较近物种的基因组序列可能造成结果不准确（笔者解读：数据库此部分非常重要，再次强调mNGS所使用数据库的重要性，如数据库缺少目标菌，则一定会造成假阴性！）。2. mNGS结果确认：如果检出的微生物符合疾病特征则可能是引起感染的病原微生物，但不能只从序列数多少确认，需考虑序列在基因组上的覆盖度、特异性及保守性（笔者解读：mNGS报告解读需综合多个指标，不能仅靠单个指标如read数判定）［11， 14］。该病原微生物可通过PCR等方法得到验证（笔者解读：其他实验方法的复核验证是mNGS非常必要的一环），如呼吸道标本中的流感病毒、腺病毒及新冠病毒等；粪便标本中的志贺菌、沙门菌及诺如病毒等；CSF中的肠病毒、单纯疱疹病毒及西尼罗河病毒等；血液中的布鲁菌、巴尔通体及人类免疫缺陷病毒等。如果检出高序列数的某种未命名微生物，应高度警惕新物种的出现。3.mNGS阳性阈值及判读标准：报告单中的阳性阈值以百万分子序列数确定。阳性阈值的确定不依赖某个单一的指标，包括但不限于特定微生物的检出序列数、归一化每百万序列（reads per million， RPM）的比值、检出物种的基因组覆盖度等。病毒因极少存活于环境中，因此，少量的特异序列检出即可判为阳性（如少于3条特异序列）［26］。避免报出与临床不相关的环境菌、共生菌及条件致病菌等。一般序列数越高病原微生物的可能性越大（数十条特异性序列）。对于结核分枝杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌等临床关注度高、且较难检测的病原菌可采用独立的判读标准（笔者解读：mNGS阳性的判断目前仍未有统一标准，需根据病原、样本、临床特征综合判断），即检出1条特异序列即可判为阳性［7， 28］。寄生虫基因组因较为复杂，且与人源基因组相似，应在严格确认序列特异性之后再行判读［14］。如果检出序列为新发物种，则可不受阈值限制，但需给出同源性比对结果。4. 微生物种群致病：无菌部位脓肿标本可见多种病原微生物共检出现象。如脑脓肿、颈间隙脓肿、咽旁脓肿、口腔脓肿等，所检出的微生物序列数均可能达到阳性阈值，多数为严格厌氧菌与兼性厌氧菌共生。这种因微生物种群而致病的现象称为一个种群或一个微生物生态系统引起一种疾病，而非Koch法则的一种病原菌引起一种疾病。尽管种群致病的理论还需进行深入探讨，但随着深度测序技术的广泛应用，这种现象在临床上将得到更多验证［29］。5.不可培养或难培养微生物的结果验证：mNGS针对标本中所有病原微生物核酸序列，不可培养或难培养微生物不能通过传统培养方法再现，且这类病原微生物同样缺乏血清学或抗原检测。除病毒、螺旋体、立克次体、寄生虫外，这些微生物可通过核酸检测验证，测序同样是诊断的金标准。6. 致病菌、定植菌和污染菌：当确定条件致病菌为病原菌时应考虑患者免疫状态、基础疾病及标本来源。若出现大量背景菌或杂菌序列而无主导微生物应首先考虑污染，其次考虑条件致病菌。如果外科手术或其他有创操作后，无菌部位来源的标本，表现为细菌单一，序列数可能不高，应结合临床考虑医院感染，此时应与背景菌区分，不可一味认为污染。mNGS不能区分微生物是定植还是感染。mNGS检测阴性对排除感染有意义，但也应结合临床表现作出正确的诊断（笔者解读：mNGS的阴性不一定是真阴性，要结合临床）［14， 28］。7. 高度传染性微生物：针对具有高度传染性的特殊病原微生物，实验室应根据相关卫生行政部门的规定制定特殊报告程序，标本上传疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC），如当出现像疑似O1群或O139群霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌、埃博拉病毒或新型病原微生物等，应尽快采用其他方法验证，如PCR、血清学等，如果支持测序结果应迅速反馈临床和CDC系统。8. 提高测序深度：mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性［8， 30］，因其得到的微生物序列数不足样本总序列的5%，特异性序列覆盖度不到微生物基因组1%，在这种情况下进行耐药基因、毒力岛基因、转录组及代谢通路分析几乎不可能。目前，有以下几种做法可提高测序深度：（1）在常规测序深度下已明确了病原微生物，再提高测序数据量至可覆盖该物种基因组80%，但花费巨大不适合普及。（2）在宏基因组基础上叠加固定的若干种耐药基因进行靶向测序。（3）研发降低人源核酸比例的创新方法，获得更多微生物测序数据量［4， 7， 31］。建议2 mNGS作为一种新型检测方法，其临床意义仍未超出核酸检测范畴，它补充了传统病原微生物确认的Koch法则。mNGS可检测难培养、罕见或新发病原微生物，可同时给出多种病原微生物信息，因此，在一份无菌部位来源的临床标本（尤其脓肿）中检出微生物种群（包括不同类别或同类不同种属）不应轻易视为污染。如果这些微生物的存在符合临床诊断，应给予抗菌药物全覆盖，这恰好体现了该技术对全面认识病原微生物的优越性。mNGS常规数据量对耐药和毒力基因检测有局限性，如需耐药和致病信息需提高测序数据量。建议3 如果检出的病原微生物符合临床预期，应确认序列结果的准确性和特异性。为提高结果的特异性，降低错误率，即使病原微生物也应建立阳性阈值。阳性阈值建立在微生物特异序列数及其在基因组覆盖度上。临床医生在解读条件致病菌时，应排除污染和背景微生物，考虑患者免疫状态及与临床表现的符合性。mNGS结果不能作为临床决策的唯一依据，结果阴性也需结合临床排除感染（笔者解读：测序技术是为临床提供依据，结果仍需以临床结果为准，不能本末倒置）。
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