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研究背景：

研究表明，肝细胞癌(HCC)的异质性是导致治疗失败的主要原因。单细胞测序(scRNA)技术可以更准确地揭示肿瘤遗传学的本质特征。肿瘤异质性在临床上表现为病理类型、肿瘤分期、分化程度的不同，在分子水平上表现为基因组和转录组的不同，最终导致对化疗和治疗药物的敏感性不同，从而给癌症治疗带来了很大的困难。自噬是一种保守的溶酶体依赖性途径，通过一个动态的多步骤过程降解细胞器、大分子和细胞质蛋白。有证据表明自噬在HCC中具有抑制肿瘤的作用。

研究结果：

一、细胞簇的定义和降维

1、图1A中列出了来自GSE149614数据集中10个样本的单个细胞的概述。所有细胞被分为11个簇(图1B)。

2、11个簇被免疫细胞标记基因标记为8种细胞类型(图1C)。贡献最大的前五个基因如图1D所示。

3、使用CopyCat包预测8种细胞类型的CNV，识别出13617个恶性(肿瘤)细胞和19500个非恶性(正常)细胞(图1E)。

4、计算了10个样本中恶性和非恶性细胞的比例(图1F)。

二、自噬途径分析

1、ssGSEA显示自噬通路在恶性肿瘤中被激活(图2A)。

2、TCGA-LIHC数据集中5条自噬通路的ssGSEA显示，肿瘤中有3条自噬通路的评分低于正常自噬通路(图2B)，而图2A则相反。

三、自噬相关集群的识别

1、根据图2B的结果，利用limma对TCGA-LIHC数据集的三条自噬通路中的253个基因进行分析，得到38个差异表达基因。

2、使用基于38个基因的ConsensusClusterPlus包对TCGA-LIHC中的360个样本进行聚类分析。当k = 2时，得到两个聚类(cluster1和cluster2)(图3C)。

3、K-M分析显示，在TCGA数据集(图3D)和HCCDB18数据集(图3E)中，cluster2组HCC患者的生存期往往短于cluster1组。而cluster2的女性较多，T分期和临床分期较高，肿瘤分级较差(图4)。

四、基因组分析和功能富集分析

1、cluster1表现出较低的非整倍性评分、同源重组缺陷和分数改变(图5A)。

2、分析不同聚类间基因突变的差异;排名前10位的基因如图5B所示。TP53和TTN在两个簇间有明显差异(图5B)。

3、GSEA显示细胞周期等通路在cluster1中被激活(图6A)，与肿瘤发生相关的10个通路中有5个在cluster2中得分更高(图6B)。

五、肿瘤免疫微环境分析

1、CIBERSORT分析显示，22个免疫细胞中有7个在两个簇间存在显著差异(图7A)。

2、ESTIMATE分析显示，cluster1的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore得分更高(图7B)。

3、评估了47个免疫检查点基因的表达，18个免疫检查点基因在cluster2中的表达明显高于cluster1(图7C)。

4、使用ssGSEA计算toll样受体信号通路、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、抗原处理和呈递的评分，在cluster1中toll样受体评分和NK细胞毒性评分高于cluster2(图7D)。cluster1的TIDE低于cluster2(图7E)，更多病人cluster1对免疫治疗有应答(图7F)。

六、中枢自噬相关基因的鉴定和风险评分

1、在cluster1和cluster2中共鉴定出344个差异表达基因(图8A)。

2、单变量Cox生存分析确定了137个与预后相关的基因(图8B)。

3、基于137个基因的表达矩阵，使用LASSO Cox回归模块构建预后特征。

4、我们根据最优l值确定了一个8个基因的signature(图8C, D)。

5、基于8个基因的HCC患者风险评分(图8E)。

七、预后模型的验证

1、在TCGA-LIHC(图9A)、HCCDB18(图9B)、GSE14520(图9C)和GSE76427数据集(图9D)中进行ROC和生存分析。结果表明，该模型对上述数据集中1、2、3、4、5年生存率的预测精度较高，曲线下面积(area under The curve, AUC)均大于0.6。

2、Kaplan Meier生存分析结果显示，低危组总体生存率高于高危组。女性患者、临床晚期患者、年轻样本和cluster2显示出更高的风险评分(图10)。

八、免疫浸润及免疫治疗分析

1、CIBERSORT分析显示，22个免疫细胞中，低组有11个明显高于高组(图11A)。

2、ESTIMATE分析显示，低组StromalScore和ESTIMATEScore较高(图11B)。

3、31个免疫检查点基因在高组中表达明显高于低组(图11C)。TIDE, IFNG, MDSC, Exclusion, TAM。M2低组低于高组，但功能障碍低组高于高组(图11D)，提示低组更有可能从免疫治疗中获益。

4、高组患者对埃洛替尼、舒尼替尼、紫杉醇、VX-680、TAE684、克唑替尼的IC50较高，提示高组患者对这些药物更敏感(图11E)。

九、诺模图

1、单因素和多因素Cox分析显示，分期和RiskScore是独立的预后因素(图12A, B)。

2、根据分期和风险评分构建预后nomogram预测HCC患者1、3和5年的总生存率(图12C)。校正曲线证明预后诺模分析是可靠和准确的(图12D)。

3、AUC的结果表明，在其他临床变量中，风险评分和诺模图在临床决策过程中作为准确的预后指标(图12E)。

总结：综上所述，为了准确评估预后风险，基于HCC免疫细胞的异质性，开发了一种8基因预后分层标记。本研究构建了由HAO2、RACGAP1、OGDHL、ZWINT、CFHR3、CYP2C9、SFN、SPP2对HCC的影响肝癌患者预后治疗的新思路。然而，本研究的研究结果的主要局限性在于我们的研究是在公共数据库中进行的，需要进一步的实验来深入研究。