技术 | PCR实验室的核酸提取，你都了解吗？

分子诊断是以核酸作为检测对象，主要应用于临床实验室各类疾病的诊断中，如肿瘤、感染、遗传等，而核酸提取是分子诊断实验的“第一步”。几乎所有实验均是以核酸提取为基础，无论后续的克隆、PCR、q PCR、建库、测序等都需要核酸提取以后才能顺利进行。核酸提取纯化质量是保证核酸检测数据准确性的前提，也是分子诊断行业发展的前提。

根据核酸提取方式不同可分为三类：磁珠纯化法、硅胶膜离心柱法、溶液型抽提法。

磁珠法原理：

运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒表面进行改良和表面修饰（如：硅基、氨基、羧基）之后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。核酸与磁珠结合主要依靠静电作用、疏水作用以及氢键作用。在裂解液作用下，RNA被释放。此时磁珠与核酸分子“特异性结合”，形成“核酸—磁珠复合物”。在Chaotropic盐（盐酸胍、异硫氰酸胍等）和外加磁场的作用下，复合物被分离。最后，经过洗脱液洗去非特异性吸附的杂质、去盐、纯化后，即得到提取纯化后的核酸。近年来，随着自动化仪器的迅猛发展，基于磁珠法原理的全自动核酸提取仪因可以满足实验室大批量样本需求，被越来越多地应用到核酸检测中。国产核酸提取仪品牌繁多，例如：西安天隆、乐普医疗等。

1、核酸提取原理

核酸提取过程包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。经典的裂解液几乎都含有去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl)等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。裂解体系中还可能加入蛋白酶；利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

2、核酸纯化

最常用的纯化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介质纯化。第一种方法是利用 PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离；再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。第二种方法则是利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了 PC操作的麻烦。当然，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。其它杂质 – 如多糖、多酚等 -的去除

3、裂解方法的评价

含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选。裂解包括膜蛋白的游离和与基因组 DNA相连接的蛋白质的游离。蛋白酶的作用是使蛋白质变小，故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用；同时，巨大的基因组 DNA是很容易“缠”住大分子的东西的，蛋白质被蛋白酶消化变小后，则不容易被基因组 DNA“缠”住，有利于蛋白质在纯化操作中的去除，使最终获得的基因组 DNA 的纯度更高。

含 CTAB的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。该方法成功与否与两个因素有关：一是 CTAB的质量，二是洗涤的彻底程度。CTAB 的质量对裂解效率有很大的影响，而且，似乎还说不清楚原因，因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB，批号不同，效果就可能差别很大。洗涤去除 CTAB 要比其它的盐难一些，同时， CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响，所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。裂解时的温度，多使用65C；但如果发现降解严重或者得率太低，可以试一下 37C – 45C 这个相对低温的区域。SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA污染的特点。控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。

4、醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质 – 主要是盐 –的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。就核酸而言，标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量，但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。

5、核酸的溶解和保存

纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少 DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。基本上，核酸在保存中的稳定性，与温度成反比，与浓度成正比。虽然也有部分实验人员发现，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的稳定，可认为这是个例。