核酸适配体为研究细胞膜受体分子提供了强有力的分子工具。然而，在核酸适配体的筛选过程中，核酸适配体与受体分子在单分子层面的结合并不能被直接观测到。此外，大多数核酸适配体的靶分子在细胞膜表面是高表达的，这些受体分子的分布密度高、运动速度快，极难实现原位分析。为了进一步发掘核酸适配体在膜受体分析领域的应用潜力，同时也为了阐明核酸适配体和受体分子之间的具体结合模式，湖南大学的谭蔚泓院士/吕一帆副教授团队提出了一种基于荧光成像中单分子定位和数学中随机取样的分析策略，称为配体稀释分析技术。与经典成像技术中采用过量荧光探针与尽可能多的受体分子相结合这一策略所不同的是，配体稀释分析技术同时使用荧光探针与非荧光探针两种探针对样品进行标记。这两种探针的识别区域在结构上是相同的，因此荧光探针可以以一个类似随机取样的过程被非荧光探针均匀稀释。当稀释倍数足够大时，相邻两个荧光探针之间的距离可以被单分子定位技术有效区分。 
图1. 配体稀释分析的基本概念验证（来源：Angewandte Chemie International Edition）
基于该项技术研究团队构建了可以计算细胞表面受体密度的回归模型。通过协同配体稀释技术进一步在单分子层面上实现了核酸适配体和单克隆抗体在同一个膜受体分子上的共定位，在此基础上，通过分子对接和分子动力学模拟，可以进一步确定核酸适配体与膜受体分子的精确结合位点和具体结合模式。利用配体稀释技术，还可以实现基于核酸适配体的受体分子动态分析，从而生成时间相关的受体分布图谱，实现高表达受体分子在活细胞膜表面的二维以及三维运动和涨落分析。具体来说，研究团队首先通过理论推导说明配体稀释是一个在分子层面随机取样的过程，并巧妙利用DNA分子工具构建了两种研究模型，通过实验证实了配体稀释在分子层面具有随机取样的性质，能够更加精确地反映出受体分子在细胞膜表面地的分布情况。 
图2. 构建密度依赖和结合力依赖的取样模型验证配体稀释技术的随机取样性质（来源：Angewandte Chemie International Edition）
同时，基于该配体稀释技术，研究团队构建了能够用于计算细胞表面受体密度的回归模型，并对CEM细胞表面PTK7蛋白的密度进行测定。此外，研究团队还发现，当直接对受体蛋白进行稀疏标记时，荧光探针的数量容易受到细胞数量的影响。采用配体稀释技术，单个细胞上荧光探针的数量能够得到有效控制，不受细胞数量影响。 
图3. 配体稀释技术用于细胞膜表面受体分子的密度分析（来源：Angewandte Chemie International Edition）
研究团队进一步提出了基于AuNP淬灭和基于DNA杂交的两种协同配体稀释技术，在单分子层面实现了局部超分辨能力的共定位以及区分核酸适配体和抗体在同一个受体分子上的不同结合位点。与此同时，通过分子对接和分子动力学模拟实验，研究团队进一步确定了核酸适配体与膜受体分子的精确结合位点和具体结合模式（核酸适配体sgc8c在膜蛋白PTK7表面的结合位点被预测位于Ig3和Ig4之间的凹陷处），彰显了配体稀释技术在研究核酸适配体与膜受体分子相互作用中的重要意义。 
图4. 核酸适配体和受体分子在单分子水平上的荧光共定位（来源：Angewandte Chemie International Edition）
最后，研究团队利用配体稀释技术的随机取样特性降低成像范围内荧光光斑的数目，以实现对单个受体分子二维坐标的精确定位以及运动情况的实时跟踪，进而实现了活细胞表面高密度受体的二维运动分析。结合入射角依赖的相关计算，还可以精确定位单个受体分子包括轴向坐标在内的三维坐标，并实时跟踪单个受体分子的侧向运动和轴向涨落，实现活细胞表面高密度受体的三维运动分析。
图5. 基于核酸适配体的配体稀释技术用于活细胞表面受体分子的三维运动分析（来源：Angewandte Chemie International Edition）
该研究成果发表于国际化学领域权威期刊《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）。该论文第一作者为湖南大学的博士生堵玉林，通讯作者为湖南大学谭蔚泓院士和吕一帆副教授。该研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会、深圳市优秀科技创新人才培养项目的大力资助。
