|
海洋生物细胞由于其复杂性，在单细胞测序实验中成功率往往较低。而BD Rhapsody凭借其特点和优势，让海洋生物单细胞测序研究不再有后顾之忧： 1.BD Rhapsody最大程度降低外界对实验的干扰 基于微孔板原理，细胞自然沉降，不会对细胞产生任何压力刺激，在细胞裂解后，磁珠捕获mRNA，之后被磁铁回收，所有外界干扰因素如化学试剂、金属离子、酶等都会被清洗，在干净的反应体系中进行后续反转录实验，最大程度降低细胞剪切力、温度、化学试剂对细胞的刺激和影响，不会改变转录本表达特征，真实还原实验设计预期条件。 2. BD Rhapsody Scanner质控系统，过程监控，确保质量 尤其是有些海洋生物细胞偏小、mRNA含量偏低，在细胞捕获过程中，会造成一定的细胞数目偏差。BD Scanner可视化质控系统，能实时监控单细胞实验情况并输出包含细胞浓度、细胞计数、细胞活性、双细胞率、细胞回收率、磁珠回收率等数据报告，从而可以及时调整实验参数，有效保证实验质量。 那么如何利用BD Rhapsody进行海洋生物单细胞实验呢？下面就跟“小海胆”一起看一篇文献实例吧~ 研究背景 合子基因组激活是胚胎早期发育过程中一个普遍的过程，涉及到合子细胞核的重编程，并启动整体转录。近些年来，研究者使用不同的生物模型来探究这个过程，并且提出了不同的合子基因组激活机制的模型，包括核质比模型，激活因子积累模型，染色质动态变化模型。然而合子基因组激活却仍未有一个共性的认知，尤其是对管家基因再激活过程。海鞘作为脊椎动物的近亲之一，已被用于胚胎研究多年，多种不同海鞘的细胞谱系已得到表征，并且也有基因组测序数据。 2022年6月1日，中国海洋大学董波研究团队和昆明理工大学陈凯团队，在bioRxiv上发表了题为“Spatiotemporal dynamics of zygotic genome activation in basal chordates revealed by interspecific hybrids”的研究论文。该研究论文利用两种不同的海鞘物种进行杂交，通过同源基因的多样性区分不同来源的基因，发现了在8细胞到110细胞阶段会有两波分别代表早期胚胎发育和管家基因再激活的合子基因组激活过程。比较分析揭示了母本与合子基因间的调控以及等位特异性表达的调控是以物种的方式而不是亲本相关的方式。作者利用BD Rhapsody单细胞平台解析了早期神经元阶段海鞘胚胎单细胞转录组谱式，揭示了父源管家基因的时空差异性激活与每种细胞类型的力学性质显著相关。这为人们了解基底脊索动物的进化和适应提供了新的研究系统。 实验结果： 两种不同海鞘物种的杂交及转录组测序 Ciona robusta 和 C. savignyi 是两种形态相似但已经分开进化122百万年的被囊动物。这两种海鞘高度分化且具有互育性，因此可以作为研究杂交胚胎的优秀模型。作者首先评估了杂交胚胎的发育能力，结果发现在尾芽期胚胎之前，不同杂交的胚胎发育时相和形态是类似的。尽管这两种海鞘形态相似，但在基因组上有很大差异，因此可以用于区分等位基因的亲本来源。为了解析合子转录本的激活，作者收集了1,2,4,8,16,32,64,100细胞时期胚胎和中期囊胚，早期神经元进行bulk RNA测序，64细胞，110细胞和早期神经元阶段进行单细胞测序。 胚胎早期发育过程中两波协调的合子激活 作者将 C. robusta 和 C. savignyi 的杂交胚胎的RNA数据比对回基因组发现，不管是Cs ♂ × Cr♀ 或 Cr ♂ × Cs♀的胚胎，在4细胞之前，>99.99%的数据都比对到了母本。父本转录组从8细胞时期开始检测到，从16到32细胞阶段比例开始显著增加。另一个阶段是从64细胞到110细胞阶段，父本转录组比例开始增加。这种父母本基因组不同比例转录本的情况在神经元早期和晚期开始消失。 作者接下来分析了基因表达水平的FPKM值，结果发现合子基因的首次表达出现在8细胞阶段，在从16到32细胞阶段以及从64到110细胞阶段开始增加。父源基因的WGCNA分析发现，Cs♂ × Cr♀子代胚胎的基因可以分为5类，1类基因在16到32细胞阶段上调，2到3类基因在64到100细胞阶段上调。GO分析发现1类基因主要与调控相关，可能在第2波合子激活过程中起到调节作用。
Figure1. 海鞘胚胎发育过程中两波协调的合子激活 杂交模型胚胎发育过程中等位基因的激活 接下来作者比较了母本中两波合子激活的调控关系。两个物种中整体调控的模式可能是相似的。作者首先鉴定了调控基序注释好的转录因子，接下来就开始查看这些转录因子与对应基因之间的调控关系。基序分析发现第一波合子激活中调控基因多与母本转录因子相关，而第二波合子激活中则与合子表达基因相关。通过比较两种物种的发育相关基因发现，合子激活中两个物种间转录因子和调控基因的关系是相似的。 作者进一步分析了等位基因特异性表达的情况，在检测到的5,879个同源基因中，有341个基因是合子特异性表达的。从8细胞到32细胞阶段的早期表达基因主要都是母本主导基因，而在64到110细胞胚胎的过渡阶段，开始检测到更多的父源基因。从110细胞胚胎到晚期神经元阶段，分别有138和106个基因是Cr和Cs主导的。
Figure2. 杂交模型胚胎发育过程中等位基因的激活 单细胞测序揭示管家基因的激活 Ciona的不对称分裂从16细胞阶段起始，时间点要比管家基因的再激活要早。同时Ciona胚胎的不变谱系的嵌合发育为研究合子激活提供了独特的优势。作者利用BD Rhapsody单细胞平台检测了早期神经元胚胎阶段的单细胞转录组。数据分析发现64细胞，110细胞和早期神经元阶段细胞分别可以被分成9,12,19个细胞群，而这些细胞群可以进一步被注释成内胚层、脊索、间充质、肌肉、神经索、神经和表皮等。作者比较了每个细胞群的合子激活。在64细胞阶段，内胚层细胞中有最高比例的父本转录组激活。在神经元早期，神经索和间充质B细胞的父系转录本增加，各类细胞群的父系转录本比例的差异开始缩小。不同谱系中父系管家基因的重新激活存在差异，这表明管家基因的重新激活并不遵循发育时钟模型。此外，作者还用这些数据检测了其他合子激活模型的可靠性。发现细胞分裂时间与合子基因激活时间不相关，细胞体积也与Ciona合子激活不相关。
Figure3. 单细胞测序揭示管家基因的激活 总结与展望 这项研究工作利用两种高度分化的海鞘进行杂交，通过同源基因的多样性来区分不同基因来源。通过对不同时期杂交胚胎的转录组测序发现，杂交胚胎的合子激活主要有两个阶段，第一波主要从16到32细胞阶，而第二波则从64细胞到110细胞阶段，父本转录组比例开始增加，并且两波合子基因组激活是有协调作用的。最终，论文通过杂交胚胎解析了合子基因组激活的过程和调控机制，并且为研究人员了解基底脊索动物的进化和适应提供了新的研究系统。在这项研究中，BD Rhapsody单细胞平台发挥了重要作用，揭示了早期神经元胚胎阶段的单细胞图谱和早期神经元阶段细胞的等位特异性表达，为解析胚胎合子激活的过程提供了数据。 单细胞多组学平台 系统组成包括：
|
|
|
