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胆固醇作为游离酸在血液中循环，并被酯化为长链脂肪酸，称为胆固醇酯。胆固醇酯是胆固醇运输和储存的首选形式。卵磷脂：胆固醇酰基转移酶是一种67kDa的糖蛋白，负责血浆中的胆固醇酯化。该酶显示出两种活性：磷脂酶A2活性，其从磷脂酰胆碱的sn-2位置水解脂肪酰基；以及转酰基酶活性，其催化脂肪酰基从酰基酶复合物转移到胆固醇的3-β羟基以形成胆固醇酯。胆固醇和胆固醇酯水平升高与动脉粥样硬化和心脏病有关。这导致了大量研究集中在胆固醇稳态的理解上。实验样品中胆固醇的定量对这项研究至关重要。 胆固醇荧光测定试剂盒为血清和血浆中胆固醇的敏感定量提供了一种简单的荧光测定方法。该测定基于检测游离胆固醇和胆固醇酯的酶偶联反应，如下图1所示。胆固醇酯被胆固醇酯酶水解成胆固醇，然后被胆固醇氧化酶氧化，生成过氧化氢和相应的酮产物。然后使用10-乙酰基-3,7-二羟基苯恶嗪（ADHP）检测过氧化氢，这是一种高度灵敏和稳定的过氧化氢探针。在辣根过氧化物酶的存在下，ADHP与过氧化氢以1:1的化学计量比反应，产生高度荧光的间苯二酚。
1.胆固醇测定缓冲液（10X）-（编号10008052） 用27 ml HPLC级水稀释3 ml测定缓冲液浓缩液。该最终测定缓冲液（100mM磷酸钾，pH 7.4，含50mM氯化钠和5mM胆酸）应用于制备标准品和稀释样品。如果在室温或4°C下储存，稀释的测定缓冲液应至少稳定一周。 2.胆固醇含量测定标准-（编号10008053） 小瓶中含有10mM乙醇胆固醇（5-胆甾-3β-醇）。该试剂可用于制备稀释胆固醇标准品。 3.胆固醇测定检测器（编号10008054） 小瓶中含有ADHP冻干粉。在加入测定鸡尾酒之前（参见第13页第4步的测定），用100µl DMSO（项目号700001）和100µl HPLC级水重新构建胆固醇检测器。重组胆固醇检测器应为稳定的HPLC级水。重组胆固醇检测仪应稳定。 4.胆固醇测定辣根过氧化物酶（HRP）-（编号10008055） 小瓶中含有HRP冻干粉。每个小瓶用200µl重新配制1个，每个小瓶用1 ml HPLC级水重新配制5个。当储存在-20°C。在冷冻之前，将每个小瓶中的5个等分为较小的等分，以便避免重复冷冻/解冻循环。 5.胆固醇测定氧化酶-（编号10008056） 小瓶中含有胆固醇氧化酶冻干粉。用100µl的HPLC级水重新配制每个小瓶1个，用500µl的高效液相色谱级水重新调配每个小瓶5个。当在-20°C下储存时，重组试剂应至少稳定一周。在冷冻之前，将每个小瓶中的5个等分为较小的等分，以避免重复的冷冻/解冻循环。 6.胆固醇测定酯酶-（编号10008057） 小瓶中含有胆固醇酯酶冻干粉。用50µl重新配制1个小瓶，用250µl HPLC级水重新配制5个小瓶。当在-20°C下储存时，重组试剂应至少稳定一周。在冷冻之前，将每个小瓶中的5个等分为较小的等分，以避免重复的冷冻/解冻循环。 7.二甲基亚砜测定试剂-（编号700001） 小瓶中含有DMSO。试剂已准备好使用。 胆固醇荧光测定试剂盒样品制备： 血浆 通常，人血浆中的胆固醇水平在2.5-7.5mM5-7的范围内 1.使用抗凝剂如肝素、EDTA或柠檬酸盐采集血液。 2.在4°C下以700-1000 x g离心血液10分钟。用移液管移走顶部黄色等离子层，而不干扰白色褐黄色层。将血浆储存在冰上，直到测定或在-80°C下冷冻。血浆样品应稳定至少一个月。 3.通常，1:200-400稀释的血浆样品应产生符合标准曲线的结果。 血清 通常，人血清中的胆固醇水平在2.5-7.5mM的范围内。 1.在不使用抗凝剂如肝素或柠檬酸盐的情况下采集血液。让血液在25°C下凝结30分钟。 2.在4°C下以2000 x g离心血液15分钟。用移液管移走顶部黄色血清层，不干扰白色血沉棕黄层。将血清储存在冰上。如果当天未进行分析，则在-80°C下冷冻。样品应稳定至少一个月。 3.通常，血清样本的1:200-400稀释度应产生符合标准曲线的结果。 |
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