 导语 今天给同学们分享一篇非肿瘤单细胞测序的生信文章“Single-cell RNA sequencing reveals rebalancing of immunological response in patients with periodontitis after non-surgical periodontal therapy”，这篇文章于2022年11月3日发表在J Transl Med期刊上，影响因子为8.44。牙周炎是口腔粘膜的主要炎症性疾病，不仅限于口腔。尽管慢性牙周炎的重要性已得到强调，但牙周炎诱导的全身免疫反应及其治疗效果仍然难以捉摸。在这里，作者报告了牙周炎患者外周血单核细胞 (PBMC) 的转录组。这些数据共同提供了对牙周治疗有反应的转录组变化和分子相互作用的见解。 1. 牙周炎患者PBMC的单细胞转录谱 作者从四个健康供体和四个配对的治疗前和治疗后患者中分离出PBMC进行scRNA-seq，并获得了111213个细胞（图1A、B）。在降维和基于图的聚类后观察到不同的细胞群。作者发现了13个对免疫反应很重要的主要细胞区，每个供体的PBMC都包含所有这些细胞群（图1E）。PBMC细胞群包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞具有正态分布，无论是否存在疾病或通过牙周治疗的慢性炎症消退状态。虽然大多数样本显示三组之间的细胞组成没有显着差异，但在牙周炎患者中，CD8T细胞的比例略低于健康对照组，而幼稚CD8T细胞比例略高于健康对照组。为了验证牙周炎患者的临床炎症状态和牙周治疗的消退，作者使用六个变量进行PCA，发现治疗前组与健康组不同，而治疗后组与对照组更相似，尽管治疗后患者的临床变量与健康对照组的临床变量不可比。这表明治疗干预改善了炎症状态并改变了牙周炎的临床特征。  图1 来自健康供体和治疗前后牙周炎患者的外周血单核细胞(PBMC)的组成 2. 慢性牙周炎患者固有免疫细胞的基因表达改变 接下来，作者研究了先天免疫细胞的转录组变化，包括单核细胞、树突状细胞(DC)和NK细胞。从图1C获得的单核细胞被重新聚类并分为三个亚型：经典、非经典和中间单核细胞（图2A）。先天免疫细胞中的DEG如图2B-D所示。在所有类型的先天免疫细胞中均观察到牙周炎患者富含CRIP1的增加，治疗后CRIP1水平与健康对照组相似，表明CRIP1可能是维持慢性炎症的重要因素。当使用预处理组特异性DEG研究GO通路时，经典单核细胞具有低水平的MHC蛋白复合物组装基因和降低的抗原呈递活性。然而，在预处理组的髓样DC(mDC)中响应LPS刺激的基因增加，并且接近与治疗后的对照组相似的强度水平（图2E）。这些结果表明，尽管单核细胞的抗原呈递功能降低，但mDC在检测到LPS后，可以通过牙周治疗来挽救。  图2 先天免疫细胞、单核细胞、树突状细胞和自然杀伤细胞中差异表达的基因 3. 慢性牙周炎患者适应性免疫细胞的系统特性 接下来，作者研究了适应性免疫细胞的转录组学变化。图1C中的B、CD4T和CD8T细胞群被提取并分离成更具体的亚型。B细胞被分为非转换MB、转换MB、衰竭B细胞和浆母细胞（图3A）。CD4T细胞分为四种亚型：Th1、Th17、Tfh和Treg细胞（图3B）。CD8T细胞分为三种亚型：TCM、TEM和TTE细胞（图3C）。  图3 牙周炎诱导的适应性免疫、B、CD4T和CD8T细胞的转录改变 与健康和治疗后样本相比，治疗前样本中表达水平发生变化的基因如图3D-F所示。CD4和CD8T细胞亚群显示治疗前患者的细胞迁移和运动减少。然而，耗竭B细胞、浆母细胞和TEM细胞的表达没有显着变化。由于先前报道TEM细胞是急性免疫反应的一部分，因此预计各组之间的TEM细胞没有差异。这表明这些无反应细胞不受牙周细菌引起的全身性炎症的影响，也不是慢性炎症的主要驱动因素。 4. 免疫细胞中的常见DEG对全身慢性炎症有反应 在所有免疫细胞中，作者发现了常见的DEG，例如CRIP1、MIF、IFITM1和RPS17。值得注意的是，在超过一半的细胞中，所有四种基因仅在治疗前患者中高度表达。在观察到差异表达的所有细胞类型中，四种基因的表达增加。CRIP1在B细胞谱系中被特异性上调，而IFITM1在T细胞谱系中被上调。然而，在治疗干预后它们都减少了，从而证明了临床变量与这些基因的表达模式之间的关系。 在这四个基因中，CRIP1和IFITM1分别在约97%和71%的总免疫细胞中过表达。对健康组和牙周炎组的血浆进行ELISA，测量CRIP1和IFITM1蛋白浓度的变化，并与炎症标志物TNF-α、CRP和ESR的变化进行比较。尽管健康组和牙周炎组之间三种炎症指标的浓度相似，但作者发现CRIP1和IFITM1水平存在差异（图3G）。此外，CRIP1水平与TNF-α水平呈正相关（图3H）。ROC曲线显示健康组和牙周炎组中CRIP1和IFITM1的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.94和0.66（图3I）。因此，这些结果表明这四种基因的水平对全身免疫反应敏感，血浆CRIP1可能是牙周炎引起的全身炎症的标志物。 5. 慢性牙周炎患者免疫细胞中的细胞通讯 为了研究可以诱导或抑制炎症信号的免疫细胞之间的细胞间通讯，作者推断了每组内的细胞相互作用。然后作者比较了各组之间相互作用的信号长度并发现了几种慢性炎症特异性串扰蛋白：B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)、CCL、CD99、SEMA4、RESISTIN、干扰素-γ(IFNG)、THBS和CD48。 6. 牙周感染引起的BTLA和IFNG途径的变化通过治疗是可逆的 BTLA介导的通路在治疗前患者中显着上调。BTLA通路由作为每组配体-受体对的BTLA-TNFRSF14组成，幼稚B细胞主要充当信号发送者（图4A-C）。然而，与其他组不同的是，pDC还发挥了发送功能。此外，预处理组中表达BTLA的pDC的比例更高（图4D）。基于BTLA-TNFRSF14串扰通过上调CD5促进T细胞中Foxp3表达的研究，作者检查了表达CD5的T细胞和FOXP3Tregs的比例变化。结果，牙周炎预处理组中CD5T细胞和FOXP3Treg的比例增加。此外，在Treg细胞中，预处理组的免疫耐受倾向明显更高（图4E）。这与之前的一项研究一致，该研究表明DC中的BTLA调节T细胞的免疫耐受性。非手术治疗后，BTLApDC比例和pDC参与BTLA相互作用，以及Tregs的耐受性与健康组相似。  图4 BTLA信号通路 相反，IFNG介导的相互作用仅出现在牙周炎症组中（图5A）。NK细胞分泌的IFNG与mDC和单核细胞上的IFNG受体(IFNGR)结合。IFNG的表达水平和IFNGNK细胞的比例在预处理组中最高（图5B，C）。此外，仅在治疗前个体的IFNGRmDC中，从DC释放的促炎细胞因子显着增加（图5D）。这表明NK细胞分泌的IFNG刺激mDCs诱导和维持牙周炎患者的炎症反应，但可以通过非手术治疗得到改善。  图5 IFNG信号通路和表达水平 7. 尽管接受了牙周炎治疗，但RESISTIN通路仍持续激活 在所有组中均观察到RESISTIN通路，健康受试者的最弱，牙周炎患者的增加（图6A-C）。在所有组中，单核细胞与所有细胞类型相互作用，但在疾病状态下，mDCs也能够启动信号转导。RESISTIN通路由与CAP1和TLR4受体的相互作用组成，并且各组之间的配体-受体对在组成上没有差异（图6D）。检查信号发送细胞中抵抗素编码基因RETN的表达模式，RETN在牙周炎组的单核细胞中表达最高，但治疗后水平显着降低，尽管未完全恢复（图6E）。此外，牙周炎组中RETN单核细胞的比例是健康对照组的两倍，但治疗后下降至与健康组相似的水平（图6F）。相比之下，在mDC中，RETN的表达水平和RETN细胞的比例仅略有增加（图6G，H）。因此，值得注意的是，治疗干预并没有挽救牙周炎引起的RESISTIN通路活性的变化。总之，虽然在一些激活RESISTIN信号通路的细胞，但参与牙周炎的mDC不受非手术治疗的影响，并继续激活RESISTIN信号通路。  图6 RESISTIN信号通路和表达水平 总结 总之，作者目前的研究报告了单细胞牙周炎的转录组变化。在这项研究中，作者揭示了牙周炎的全身免疫效应，并确定了牙周炎特异性炎症预测因子。此外，基于对治疗有反应的免疫通路，作者发现对治疗无反应的通路可能会增加合并症的风险。因此，作者建议可以解决慢性全身炎症的目标途径，但这些治疗目标将需要实验验证。对非肿瘤感兴趣的老师，欢迎扫码咨询！ |
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