张卫东 教授
中国人民解放军海军军医大学药学系天然药物化学教研室主任
国家药典委员会天然药物专业委员会副主任委员
世界中医药学会联合会网络药理学专业委员会副理事长
中国药学会中药和天然药物专业委员会副主任委员
国家杰出青年基金获得者
国家重点领域科技创新团队“基于中药的新药发现”学科带头人
多年来致力于天然药物化学、中药及复方的药效物质基础、作用机理以及创新药物研究。
天然产物在药物发现中具有重要作用。大部分天然药物，经过长期的临床应用，疗效确切，使用安全性高。目前有60%的临床应用药物来自天然产物及其衍生物。从天然产物中寻找高效低毒易得的先导化合物是药物研究的热点。因此，天然产物是新药的重要来源。其中，斑蝥素、高三尖杉酯碱、槐定碱等都是我国源于中药活性成分的新抗肿瘤药研发成功案例。
一、现代创新中药研究的不足
目前，多数中药没有明确的分子靶点，作用机制不清楚，大多是在一些动物模型上部分地验证了治疗作用，无法遵循现代新药研究从先导物发现、先导物优化到候选药物的优化过程。系统SAR的研究几乎不可能，无法保证让最优秀的化学实体进入临床研究。
中药成分的ADME的研究不深入，代谢稳定性研究不足，体内过程不清楚，临床给药不合理。
由于作用机制不清，临床研究也无法保证精准用药，导致临床疗效偏低。因此，评估一个药物或者中药小分子时，希望看到小分子在细胞中的定位，需要鉴定小分子的靶标与病理机制的关联。
创新药物是靶标驱动的创新药物研究模式，我国缺乏原创新药的关键科学问题是没有自主新靶点。
二、蜂毒肽构象锁定衍生物的设计合成及其溶瘤免疫作用机制
天然来源多肽是抗肿瘤药物发现的重要源泉。多肽是探索重大疾病的关键分子探针和新药创制的重要先导化合物。相比传统小分子药物，多肽药物往往具有高效、安全、耐受性等优势。
目前，已上市的多肽药物超过90个，临床在研的达150个。
溶瘤免疫疗法(oncolvtic-immunotherapy)是一种新型肿瘤免疫治疗策略，可选择性杀伤肿瘤细胞，继而释放肿瘤相关抗原，启动肿瘤免疫循环。蜂毒肽（Anoplin）作为一种天然抗菌肽，由10个氨基酸的两亲性a-螺旋结构构成，已被证明具有一定的溶瘤活性，并且具有结构简单、溶血活性低等优点，有望开发为新型溶瘤肽。也因此，蜂毒肽是具有开发潜力的中药来源溶瘤肽。订书肽(Stapled peptide)是一种以碳氢键为支架来稳定a-螺旋结构的多肽，能够显著提高多肽的螺旋稳定性和生物活性。由于Anoplin的抗肿瘤活性高度依赖其a-螺旋结构，因此适合订书肽策略对其进行结构修饰。
Anoplin通过结构修饰后，从中筛选出最好的构象锁定蜂毒肽被称为Ano-3，其a-螺旋程度稳定程度增强了15.8倍，体外抗肿瘤活性提升了47.8倍，能诱导肿瘤细胞膜快速收缩破裂。在Ano-3的基础上，我们进一步修饰结构优化出 Ano-3s，发现Ano-3s可维持Ano-3具有的溶瘤性质，并具有更强的蛋白酶稳定性(>16倍)，且活性仍然优于阳性药LTX-315。
动物实验显示，构象锁定蜂毒肽促使黑色素瘤小鼠肿瘤消融，仅3次给药，就有50%达到治愈。构象锁定蜂毒肽的体内溶瘤免疫作用评价及机制发现，Ano-3s体内溶瘤效果依赖于免疫细胞CD8+T细胞的高效浸润。构象锁定蜂毒肽的设计合成及溶瘤作用机制显示，基于天然蜂毒肽设计合成得到有效抑制黑色素瘤的构象锁定溶瘤肽，阐明了构象锁定蜂毒肽的溶瘤免疫协同作用机制，为构象锁定技术在天然多肽药物的开发和应用提供创新思路。
在构象锁定蜂毒肽偶联PD-L1靶向肽的创新应用方面，创新设计构建构象锁定蜂毒肽偶联抗PD-L1多肽的PEG嵌合物，巧妙利用抗PD-L1多肽的肿瘤靶向和免疫检查点封闭的双重作用，实现蜂毒溶瘤肽的体内长循环和增强的结直肠癌溶瘤免疫疗效。
Weidong Zhang Theranostics. 2022, 12(7), 3456-3473.
三、川楝素PROTAC降解STAT3发挥抗肿瘤作用及其机制的研究
STAT3与上皮源性恶性肿瘤密切相关，能够促进新生上皮癌变，且在头颈癌和结直肠癌中的表达高居前两位。当前的头颈癌和结直肠癌的治疗策略仅对早期患者有效，对复发和转移性肿瘤疗效欠佳。患者容貌受损，生活质量严重下降放化疗存在严重毒副作用，易耐药。缺乏特异性靶向药物;现有小分子抑制剂局限性免疫治疗个体差异大，患者响应率不佳。然而，STAT3在肿瘤中的重要性及调控策略具有一定的局限性，被认为是“不可成药”靶蛋白，非磷酸化STAT3存在转录功能，因此亟需探索可完全抑制STAT3活性的新型药物。
蛋白靶向降解嵌合体（PROTAC）技术是利用双功能分子化合物将靶蛋白和细胞内E3泛素连接酶拉近，启动泛素-蛋白酶体蛋白降解途径特异性降解胞内靶蛋白。事件驱动药理学结合模式，降低脱靶风险，降解总蛋白，防止结合位点突变，发挥催化特性，避免大量用药。
最终，亲和力筛选得到靶向结合STAT3的中药小分子-川楝素TSN(Kd=296 nM)。中药PROTAC分子TSM-1诱导“STAT3-PROTAC-E3泛素连接酶”三元复合物的快速形成，高效降解STAT3蛋白。
四、AIN靶向PRDX1/2抗结直肠癌
目前，AIN化合物作用机制研究很少。AinsliadimerA是本课题组2008年从中药大头兔耳风中分离出来的一个具有复杂且独特新颖结构骨架的倍半萜内酯二聚体，具有很好的抗肿瘤和抗炎活性。
前期抗肿瘤活性筛选发现天然产物AinsliadimerA对多个肿瘤细胞都具有很好细胞毒作用而且具有一定的选择性。雷晓光课题组采用化学探针钓蛋白(pull-down)方法发现AIN可选择性结合IKKα/β保守的46位半胱氨酸残基，通过变构效应抑制它们的活性，从而抑制经典和非经典的NF-KB信号通路。
那么，AIN是否存在其他与肿瘤相关的靶点，并且其抑制肿瘤细胞生长的作用机制是什么？活死细胞染色实验以及流式细胞术均显示，AIN能够显著促进结直肠癌细胞凋亡。进一步研究发现，AIN通过升高ROS杀伤结直肠癌细胞，在AIN给药1.5h后显著升高HCT116及RKO细胞ROS水平，AIN和活性氧清除剂NAC联合用药后，AIN完全丧失其杀伤结直肠癌细胞的能力。此外，AIN显著降低HCT116及RKO细胞线粒体膜电位，并且该作用被NAC逆转。
动物实验发现，AIN能够抑制小鼠结直肠肿瘤生长，且安全性较好。进一步使用人结直肠肿瘤类器官研究发现，AIN也能够抑制人结直肠肿瘤类器官细胞生长，显示出非常好的治疗效果。
为了寻找AIN的潜在作用靶点，研究者团队采用3种组学方法确定AIN靶点，CMAP技术预测出AIN与withaferin A功能相似，而withaferin A被报道为NF-kB和PRDX1的抑制剂。基于药物与靶蛋白结合后使蛋白结构更加稳定的原理，DARTS蛋白质组学筛选出257个具有稳定性的差异蛋白；TPP蛋白质组学筛选出31个具有稳定性的差异蛋白；两者交集得到 PRDX1/2/4蛋白。
为了验证靶点，基于细胞的热转移实验(CETSA) 结果显示，AIN组的PRDX1/2蛋白均呈现明显的热稳定性。微量热泳动(MST)实验证实AIN与PRDX1/2有较好的亲和力，表明 AIN与PRDX1/2蛋白具有明显的结合作用。证明PRDX1/2是AIN的潜在靶点。
AIN与PRDX1的结合位点为Cys173，AIN与PRDX2的结合位点为Cys172。AIN显著抑制PRDX1和PRDX2的酶活性。在AIN处理的HCT116细胞上过表达PRDX1/2后IC50值升高，AIN抗肿瘤药效减弱，提示AIN通过靶向PRDX1/2抗结直肠癌。
