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N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物RNA分子中极为常见和丰富的修饰。由甲基转移酶复合物METTL3催化m6A修饰，并通过M6A RNA去甲基化酶FTO和ALKBH5，以α-酮戊二酸(α-KG)-和Fe2+-依赖的方式催化M6A去甲基化。METTL3、FTO和ALKBH5在许多生物中起着重要作用，从发育和代谢到生育的过程。在所有RNA碱基甲基化中，m6A占80%以上，存在于各种物种中。m6A主要分布在mRNA中同样也发生在非编码RNA中，如tRNA、rRNA和snRNA。在mRNA转录物中m6A的相对丰度已被证明影响RNA代谢过程，如剪接，核输出，翻译能力和稳定性，以及RNA转录。由m6A RNA甲基酶和脱甲基酶缺陷引起的m6A甲基化水平异常可能导致RNA功能障碍并引起疾病。 例如，由于FTO突变患者的FTO活性增加，靶m RNA中m6A的异常低水平，通过一种未定义的途径，导致肥胖和相关疾病的发生。对RNA的化学M6A修饰的动态性和可逆性，也可作为一种具有深远生物学意义的新表观遗传标记。因此，更多有用的信息，以更好地理解m6A RNA甲基氧化RNA 转录物的水平和分布有利于疾病的诊断和治疗。 目前，有几种方法被用于表位范围的m6A映射。这些方法包括MeRIP，PA-m6A-seq，miCLIP和m6A-CLIP。MeRIP已被广泛应用，但在m6A分析中无法实现高分辨率。PA-m6A-seq、mi CLIP和m6A-CLIP提高了分析分辨率，但由于重复性差和工艺复杂。特别是，这些方法耗时（>2天）和费用昂贵。为了解决这些问题，m6A RNA甲基化片段富集试剂盒来了~ m6A-RNA甲基化片段富集试剂盒【简称：MeRIP试剂盒】有以下特点： 1、高度富集：使用RNA 切割酶混合物同时对含有m6A 的目标序列两端的RNA 进行片段化和切割/移除任何RNA 序列，而不影响被抗体占据的RNA 区域。短片段RNA 仅与抗m6A 抗体结合。因此，非常可靠地确定真正的m6A 富集目标区域，并可实现高分辨率绘图。 2、低输入：不结合的RNA 切割和免疫捕获是在同一个单管中处理的，这样可最大限度地保护含有m6A的目标区域，并最小化样本损失，允许输入RNA 低至500ng。 3、极小背景：在含m6A 目标序列的两(2)端切割非结合RNA 序列，可最小化MeRIP/测序背景，允许1000万读的数据分析。 4、超快速、精简程序： 从RNA 到cDNA 文库的过程小于3 小时，动手时间<30 分钟。 5、超级方便： 本试剂盒包含了每一步所需的所有组件，这足以捕获含m6A 的RNA 序列，从而允许以一种很方便的方法来富集，结果可靠一致。 m6A-RNA甲基化片段富集试剂盒检测原则和程序： EpiQuik™ CUT&RUN m6A RNA富集（MeRIP）试剂盒包含所需的所有必要试剂用于从总RNA开始成功地进行m6A RNA富集。在反应中，RNA切割/去除包含靶m6A的区域两端的序列 使用珠结合的m6A捕获抗体将含有m6A的片段下拉。富集的然后释放、纯化和洗脱RNA。试剂盒中包括非免疫IgG对照和m6A阳性对照。这些可用于证明试剂盒的功效和富集RNA定量或生物分析仪步骤。
图1：使用EpiQuik富集m6A RNA™ 切割并运行m6A RNA富集（MeRIP）试剂盒：捕获含有m6A的RNA片段通过抗m6A抗体（#A-1801，EpigenTek）从10µg人RNA和500ng阳性对照寡核苷酸。非免疫IgG用作阴性对照。富集的RNA是纯化并荧光定量用于富集倍数比较。 图2：文库片段的大小分布：m6A片段富集通过抗m6A抗体（#A-1801，EpigenTek）并用于cDNA文库制备。峰值195 bps反映m6A抗体结合的RNA插入大小（约55个基点） |
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