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文章信息 题目：CRISPR-induced miRNA156-recognition element mutations in TaSPL13 improve multiple agronomic traits in wheat 刊名：Plant Biotechnology Journal 作者：Bing Yang, Wanlong Li et al. 单位：University of Missouri, Columbia, Missouri, USA 日期：20 November 2022    01 摘要  提高粮食产量一直是小麦遗传改良的主要目标。SQUAMOSA启动子结合蛋白样( SPL ) 基因编码了一个小家族的不同植物特异性转录因子，代表了提高水稻产量和其他主要农艺性状的重要目标。小麦中SPL基因的功能在这方面仍有待研究。 在这项研究中，我们鉴定了属于 19 个同源组的水稻SPL基因的 56 个小麦直系同源物。与水稻一样，9 个直系同源TaSPL基因在除TaSPL13外的最后一个外显子中含有 microRNA156 识别元件 (MRE), 它在其 3'-非翻译区 (3'UTR) 中包含 MRE。我们使用 CRISPR-Cas9 修改了TaSPL13的 MRE，并在三个同源基因中产生了 12 个突变。正如预期的那样，MRE 突变导致TaSPL13突变转录本增加了大约两倍。 表型评估表明，TaSPL13中的 MRE 突变导致开花时间、分蘖数和株高的减少，以及随之而来的籽粒大小和数量的增加。结果表明，TaSPL13突变体表现出在拟南芥AtSPL3/4/5突变体和水稻OsSPL13/14/16中观察到的不同表型的组合突变体并通过同时增加籽粒大小和数量以及通过改良植物结构在提高小麦产量方面具有巨大潜力。产生的新型TaSPL13突变可用于小麦育种计划，以改善这些农艺性状。 02 技术路线 CRISPR/Cas9 转基因植物在小麦品种 Fielder和 T 1群体中的发育。所有的小麦植株都生长在含有 Pro-Mix BX 生长培养基（Growers House，Tucson，AZ）的塑料盆中 在 Ensembl 植物上使用 BLASTP 工具搜索小麦基因组的 SBP 域，并使用 MEGA7 软件使用具有 1000 个 bootstrap 重复的邻接法构建树 突变检测和基因分型 RT-qPCR 分析、双荧光素酶测定 Sanger测序和序列分析 手动记录穗的小穗数、每个穗的粒数和每个穗的小穗数 系统发育分析 03 主要结果 3.1 小麦SPL基因的系统发育分析 使用 SQUAMOSA 启动子结合 (SPB) 域作为查询搜索小麦蛋白质组序列 (IWGSC, 2018 )，在 19 个直向同源位点鉴定了 56个 TaSPL基因，这些基因以其水稻同源基因命名以便于比较，除了OsSPL5的小麦直系同源物，它被命名为TaSPL21（表 1；图 1a）。虽然没有发现OsSPL11/12/19的直系同源物，但在OsSPL10上检测到重复小麦基因组中的直向同源位点。因此，三个SPL10旁系同源物被命名为TaSPL20/22/23，其中TaSPL23之前曾在同一名称下进行过研究（图 1；表 1）。TaSPL10/20/22/23在第 7 组染色体上形成串联簇（表 1），并且在系统发育树中彼此相邻（图 1a）。搜索大麦、短柄草、玉米、水稻、高粱和二倍体（T. urartu和Aegilops tauschii）和四倍体小麦物种（T. turgidum），我们发现除四倍体小麦外的所有物种在SPL10位点仅包含一个成员。与六倍体小麦一样，四倍体小麦（硬粒小麦和野生二粒小麦）在共线区域具有三个相似的基因。这些结果表明该簇对多倍体小麦具有特异性，表明复制发生在第一轮多倍化过程中，产生四倍体小麦并传递给六倍体小麦，并且重复发生在六倍体化后的 D 基因组中。除了TaSPL23，其 B 基因组拷贝在小麦参考基因组中缺失，其余 18 个TaSPL的所有三个同源基因均存在基因（表 1）。因此，SPL基因家族成员在草类中大部分是保守的，但在小麦谱系中通过多倍化显着重塑。 在 19 个直系同源TaSPL中，TaSPL2/3/4/7/13/14/16/17/18携带位于除TaSPL13之外的编码区的 miR156 MRE （图 1b）。与其水稻直系同源物OsSPL13一样，TaSPL13编码最小的 SPL 蛋白，仅包含 SBP 结构域并在其 3'UTR 中包含 MRE。挖掘小麦转录组数据库 WheatExp ( https://wheat.pw./WheatExp/ ) 揭示了所有九个 miR156 调节的TaSPL基因在大多数小麦组织中表达，在穗和茎中检测到的水平最高（图 1c）。每个TaSPL的三个同系物存在于 A、B 和 D 基因组中，但并非所有同源基因的表达都相同。在某些情况下，一个同源基因在所有组织中都比其他同源基因占优势。例如，TaSPL1 的 A 基因组同源基因、 TaSPL2/13的 B 基因组同源基因以及TaSPL3/4/9/18/20/22的 A 和 D 基因组同源基因优于其他基因组（图 1c ） ), 表明TaSPL基因的表达可能在多倍化后被重新编程。在穗状花序中检测到这些基因的最高表达（图 1c），这表明它们在穗状花序发育和形态中的作用。在TaSPL10/20/22/23集群中，TaSPL23不在八种组织中的任何一种中表达，而TaSPL10/20/22在年轻和成熟的尖峰中表达（图 1c），表明在这些SPL基因复制后发生亚功能化。
3.2 通过 CRISPR/Cas9编辑TaSPL13的 MRE 因为 MRE 在TaSPL13的 3'UTR 中，所以 MRE中小插入缺失（插入/缺失）的 NHEJ 突变预计会增加TaSPL13转录本的丰度，并且不会改变 TaSPL13 蛋白的氨基酸序列。MRE 在反义链中包含两个 PAM 基序，这将有助于靶向 MRE 序列以破坏 miR156 结合（图 2a）。 以前，我们在 Fielder 中开发了转基因植物，表达针对TaSPL13的 MRE 的 CRISPR/Cas9 （图 2a、b ），并在两个 T 1群体中发现了两个突变，即TaSPL13的 MRE 中的 10-bp 和 25-bp 缺失-一种分别在 32 号和 38 号植物中。进一步筛选这些突变品系的 T 2和 T 3后代导致鉴定了另外十个突变，六个在TaSPL13-B中，四个在TaSPL13-D中（图 2d；表 2）。在TaSPL13-B的六个突变中，两个突变（均为 1-bp 插入）被限制在 MRE 内。其中一个 1-bp 插入在TaSPL13-a（10-bp 缺失）的背景中恢复并指定为TaSPL13-ab，另一个从另一个 T 1中恢复种群作为单个突变并设计为TaSPL13-b。其余四个突变是扩展到编码区的大缺失（图 2d；表 2）。有趣的是，两个 1-bp 插入都是相同的核苷酸（胸腺嘧啶），插入到来自两个不同 T 2群体的TaSPL13-B中的相同位置。这两个突变在表型分析期间被视为独立事件，因为它们是在不同的 T 2植物中产生和恢复的。四个TaSPL13-D突变，一个 5-bp 缺失和一个 33-bp 缺失发生在 MRE 内，另外两个突变，一个 39-bp 缺失和一个 75-bp 缺失扩展到TaSPL13同源拷贝的编码区（图 2d；表 2 )。选择 TaSPL13-A中的突变、 TaSPL13- B中的 1-bp 插入和TaSPL13-D中的5-bp 缺失进行进一步评估，因为这些突变不影响 TaSPL13 蛋白的氨基酸序列。 尽管 MRE 突变在增加TaSPL13基因的表达方面具有功能获得性，但双重或三重突变，特别是TaSPL13-A和TaSPL13-B的双重突变，可能会增强突变体的表型。因此，我们通过遗传杂交组合了 A-、B- 和 D- 基因组拷贝中的突变，并获得了双重和三重突变系。双突变体TaSPL13-ab (aabbDD) 是通过在 TaSPL13-A 中 10-bp 缺失的背景下识别 TaSPL13-B 中的第一个 1-bp 插入而开发的，而三重突变体TaSPL13-abd是由结合TaSPL13-A中的 25-bp 缺失， TaSPL13-B中的第二个 1-bp 插入，以及通过遗传杂交在TaSPL13-D中删除 5-bp 。
3.3 MRE 突变干扰 miR156 介导的TaSPL13抑制 为了验证 miR156 对TaSPL13的抑制活性并量化 MRE 突变的影响，我们进行了双荧光素酶测定。在荧光素酶测定中，烟草叶被农杆菌渗透，这些农杆菌克隆过表达小麦的单个 miR156 编码基因，并携带连接到萤火虫荧光素酶 ( F-LUC ) 的 3'UTR 作为靶标和海肾荧光素酶的野生型或突变体 MRE 位点( R-LUC ) 作为内部控制。与野生型 MRE 相比，完全失去 MRE 控制显示出高 5.3 倍的荧光素酶信号，这意味着TamiR156基因在烟草中具有抑制活性。 MRE 突变对TamiR156介导的LUC基因抑制具有不同的影响（图 3a）；TaSPL13-B的 1-bp 插入、TaSPL13-A的 10-和 25-bp 删除以及TaSPL13 -D的 5-bp 删除导致比F-LUC信号多2 至 4 倍 ( P < 0.05)完整的 miR156 MRE，分别。这表明TaSPL13的 MRE是小麦 miR156 的靶标，MRE 位点的破坏可导致TaSPL13的转录本丰度增加。
3.4 TaSPL13-b/ab/abd突变体具有早花表型 其他TaSPL13突变的发展，特别是双重和三重突变，提供了表征该基因在小麦中的功能的机会。为此，我们在 2019 年秋季和 2020 年春季在温室条件下对TaSPL13突变体的开花时间、分蘖数、株高、每穗粒数和粒大小进行了表型分型。与 WT 分离子相比，TaSPL13-b/ab/abd突变体提前 1-2 周开花（图 4a-h和图 S2a-e）。秋季生长的 WT 植物在 73 天抽穗并在 81.8 天开花，而在春季生长的植物在 50.3 天抽穗并在 60 天开花。TaSPL13 -ab突变体提前 11 天（P = 1.56E-03）开花 10 天（P = 5.45E-03），并 在秋季早些时候 成熟 15 天（P = 1.43E-09）（图4b、e、g、h )，而在春季，相同的突变体 比 WT 植物早 5 天 ( P = 5.62E-06) 开花 6 天 ( P = 1.49E-05)（图S2b、d、e）。TaSPL13 -b单突变系显示出与TaSPL13-ab系相似的表型（图 4a、d、g、h和图 S2a、d、e）。此外，两个具有缺失的敲除线延伸到编码区与 WT 相比， TaSPL13-B在春季抽穗和开花至少晚 12 天（P < 3.05E-06；图 S3a、b）。这些结果表明TaSPL13蛋白参与了小麦的相变和生殖发育。 突变品系的开花特性在不同季节保持一致。在拟南芥中，AtSPL3/4/5蛋白与开花位点 T (FT)-FD 模块物理相互作用，通过直接上游激活LEAFY (LFY)、FRUITFUL (FUL)和APETALA1 (AP1)促进营养到生殖的转变。小麦TaSPL13与拟南芥AtSPL3直系同源，小麦VERNALIZATION 1 (TaVrn1)与拟南芥AP1直系同源。我们检查了TaVrn1的表达，发现与 WT 相比，它在双突变体TaSPL13-ab中增加了 2.3 倍（ P = 1.7E-09；图 3b）。该结果表明TaSPL13和AtSPL3在相变和开花方面的假定功能保守性。
3.5 TaSPL13突变减少了分蘖数和株高 随着早花，TaSPL13-b/ab显示出分蘖能力和株高特征降低。在秋季，TaSPL13-b/ab植物的株高降低了 >7.17%（从 84.5 厘米到 74-78.44 厘米；P < 0.05；图 4a、b、d、e、i）和 >33.3% 的降低与 WT 相比，每株植物的分蘖数（P < 0.05；图 4a、b、d、e、j）。但TaSPL13-b/ab与春季生长的 WT 植物 之间的株高和分蘖数差异不显着（图S2f，g）。对于三重突变系TaSPL13-abd观察到类似的趋势在两个季节（图 4c、f、I和图 S2c、f），除了分蘖数（图 4c、f、j和图 S2c、g）。TaSPL13-abd的分蘖数在秋季 ( P = 0.0613) 和春季 ( P < 0.05；图 S2f,g )减少了 27% 。 值得注意的是，与TaSPL13-ab/abd品系相比， TaSPL13-b品系对株高和分蘖数的影响相似或更显着，表明 B 基因组拷贝是TaSPL13的主要贡献者介导植物生长发育。为了验证这种可能性，我们测量了两个TaSPL13-B基因敲除品系的株高和分蘖数。与 WT 相比， TaSPL13-B的两个独立敲除品系的株高至少增加了 15%（P < 1.99E-05；图 S3c），但这些突变品系的分蘖数不受影响（P > 0.24）。 3.6 TaSPL13突变增加了每个穗状花序的籽粒大小和籽粒数 我们开发TaSPL13突变体的主要目标之一是提高小麦籽粒产量构成。因此，我们在秋季和春季对突变体和 WT 植物的每个穗粒数、粒大小和千粒重 (TGW) 进行了评分。在秋季，与 WT 相比，TaSPL13-b主茎穗上的粒数增加了 18.6%（ P = 0.0246，图 5a、d）。每个穗的小穗数没有显着变化 ( P = 0.8194)，而与 WT 相比，TaSPL13-b品系 的每个小穗的种子数增加了 13.75% ( P = 0.0213，图 5a,e )。粮食面积和TGW与 WT 相比， TaSPL13-b植物也分别增加了 11.2%（P = 7.3E-06，图 5f）和 5.9%（P = 0.0353，图 5i）。籽粒尺寸的增加是由籽粒宽度的增加（7.9%；P = 2.19E-05；图 5c，g）和籽粒长度的增加（4.0%；P = 0.0054；图 5h）和前者的程度更大。TaSPL13-ab显示了晶粒面积的可比结果（增加 12.8%；P = 9.17E-06；图 5c、f），但籽粒数量的增加并不显着（6.0%；P = 0.3; 图 5d ) 。 在春季，与野生型相比， TaSPL13-b和TaSPL13-ab突变体的每穗粒数和每穗小穗数均未增加（ P > 0.9183；图 S4a、b），而籽粒大小增加了 4.8%， TaSPL13-b（P = 0.0034；图 S4c ）和TaSPL13-ab突变体为6.2% （ P = 0.01；图 S4c）。TGW 在TaSPL13-abd中增加了 12.5% （P < 0.05；图 S4d ），在TaSPL13-b中增加了约 10%，但水平不显着（P = 0.14；图 S4d）。这些结果表明，TaSPL13突变在秋季和春季都增加了籽粒大小，尽管存在数量差异。
 04 结论 为了深入了解SPL基因在调控产量成分和其他农艺性状中的功能，我们对六倍体小麦中的TaSPL基因进行了系统发育分析和域预测。基于系统发育分析，我们鉴定了与水稻OsSPL13直系同源的TaSPL13基因，这是小麦中唯一的SPL基因，其在其 3'-非翻译区（3'UTR）携带 miR156 的 MRE。 针对TaSPL13的 MRE使用 CRISPR-Cas9，我们在六倍体小麦 Fielder 中开发了 12 个 NHEJ 突变。我们随后分析了TaSPL13-B和TaSPL13-AB的单个突变体的表型效应。TaSPL13-B和TaSPL13-AB中的突变显示出多效表型效应，即每穗种子数增加、分蘖减少、粒宽增加、高度降低和开花提早。我们的结果表明TaSPL13和OsSPL13存在功能差异。 05 原文获取 原文链接： https://onlinelibrary./doi/full/10.1111/pbi.13969 END 06 广告 |
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