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载体构建很困难？图解每一步，手把手教你模拟构建载体。 我们以香蕉枯萎病FPD1基因为例，进行模拟载体的构建。 首先我们将FPD1基因的登录号EU334871.1在NCBI数据库上进行搜索，找到FPD1基因的序列，在FPD1基因中，我们可以看到FPD1基因是complete cds，基因全长为1013 bp, 含有一个47 bp的内含子,编码序列长度为966 bp，这是我们需要的看的数据，这些数据对于我们进行与其他物种的同源性比较都很有帮助。 随后我们点击NCBI的fasta格式，将FPD1基因序列复制下来，进行NCBI blast比对，找出FPD1基因的同源性最高的全基因组。 进过比对，第二个序列就是我们要找的，点击进去可以看到该全基因全长5008 bp，编码区为2310到3322，确定同源基因序列。 随后将FPD1全基因和FPD1基因序列复制下来，用记事本制成fastag格式文件，用于后续的操作。 用生物学软件snapgene打开FPD1全基因序列和FPD1基因，进行两条序列的比对，查找FPD1基因在FPD1全基因序列的具体位置，进行同源臂的设计。通过比对，可以得出FPD1基因在FPD1全基因序列的2310bp-3321bp之间，相似率达到99.7%。 随后我们在FPD1全基因序列中在2310bp-3321bp之间把FPD1基因标红，红色部分为目的基因，以目的基因前后延伸1000bp左右，作为我们的同源臂，同源臂设计长度最好是1000bp，太长连接载体难度过高，太短不容易同源重组。 在snapgene中将FPD1基因的同源臂找到后，设置DNA颜色，方便我们观察，A臂颜色为蓝色，B臂颜色为紫色，设置成图谱，可以更加直观的看到FPD1基因、AB同源臂在FPD1全基因的具体位置。 选择蓝色序列前18个bp设计A臂上游引物，引物设计长度一般是15—30bp，上下游引物退火温度相差不超过2度，GC含量40—60%，同源臂引物设计还需要选择酶切位点，酶切位点选择目的基因片段没有的，但是载体有的，因此在A臂的上游引物酶切位点为KPNI，添加酶切位点，随后增加两个保护碱基，保护碱基可以使限制酶有效的进行酶切，同理AB臂的上下游引物也是如此。 随后我们在snapgene中点击图谱，可以看到设计好的整个AB已经添加好酶切位点的同源臂引物。 随后我们分别采用snapgene中一个特殊的功能，模拟载体连接，点击“行动”中的“PCR”将AB同源臂扩增出来，方便后续插入载体。 随后点击插入片段，选择PCT74质粒作为载体，将AB同源臂插入到载体两端，在A同源臂插入中，选择相应的酶切位点，下方则会显示出模拟的示意图，可以直观的了解整个模拟插入行动。
将插入有A同源臂的载体进行克隆，得到克隆A，然后以此为模板，将B同源臂以相同的方式插入，得到含有AB同源臂的载体。
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