无缝克隆

基因克隆的引物设计及目的DNA片段的扩增，与常规PCR法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化。

传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。

无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。

1、位点选择灵活：载体任意位置基因克隆；

2、快速简便：省略酶切、割胶回收、酶连等过程，大约1h完成载体构建；

3、精确：不需要增加任何额外的程序；

4、克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；

5、一次进行多片段目的基因的重组；

优点：

· 开放的技术平台，任何质粒、任意位置、任何目的基因都能适用，位点

选择灵活。

· 使得PCR产物克隆彻底摆脱了中间载体、重复亚克隆重复筛选的烦恼，

一步进行多片段目的基因的无缝拼接，不受PCR产物末端影响。

· 速度快，操作简便，重组效率高。

缺点：

· 需要通过PCR，目的基因不易在不同载体间穿梭

· 某些时候重复序列或者粘性末端形成的二级结构会影响成功率。