【原】分子克隆｜第3期. 质粒构建你只需要四步

如果大家想在细胞中表达一个基因，离不开表达基因的质粒克隆。前边几期给大家介绍了引物设计（PCR引物设计｜第1期. 手把手教你学会用Pubmed进行引物设计）和质粒图谱解析（分子克隆｜第2期. 你会解析质粒图谱信息吗？），今天我们教大家如何运用前边学到的引物设计和图谱解析来进行质粒构建。我们以最传统的T4 DNA连接酶的方式为例进行质粒构建实操讲解。

目的基因：小鼠的P53基因CDS（coding sequences）全长（P53蛋白表达序列），表达载体pcDNA3.1.H1-NP(Plasmid #134367)。

一．目的基因P53 CDS区全长的克隆

1. 设计P53 CDS区全长的克隆引物

用Snap Gene打开小鼠P53基因序列，在sequence界面手动选择P53 CDS区全长的克隆引物，如图所示，克隆引物一般选择克隆基因首尾的基因序列，引物长度20bp左右，Tm值60℃左右，且上下游引物Tm值相差不超过4℃。

设计并注释好引物后，可以在Primer界面看到我们注释的引物详细信息。

2. 目的基因加酶切位点和保护碱基

目的基因酶切位点的选择和载体的酶切位点相同，且所选择的酶切位点在目的基因的克隆序列中不能含有。酶切位点在Enzyme界面查看，参考分子克隆第二期（分子克隆｜第2期. 你会解析质粒图谱信息吗？）。保护碱基可以去百度搜索保护碱基表，如下图所示，根据不同的酶切位点选择切割效率最高的保护碱基。我们选择NheI和XbaI两个酶切位点，其保护碱基如下图所示，将酶切位点和保护碱基添加在克隆引物上，添加好的P53克隆引物序列如下：

P53-F：CTAGCTAGCTAGatgactgccatggaggagtcac

P53-R：GCTCTAGAGCtcagtctgagtcaggccccac

3. 目的基因克隆扩增

克隆扩增的酶一定要选高保真酶（防止基因突变），按照高保真酶的说明书进行PCR操作。PCR扩增完，跑琼脂糖凝胶，目的片段进行切胶回收，回收完测浓度和纯度，进入酶切环节。

二、目的基因和载体进行酶切，回收

根据载体多克隆位点处的酶切位点并联合目的基因序列分析，我们选择NheI和XbaI两个酶切位点，两个内切酶共用NEB公司的cutsmart buffer可以进行双酶切，且这两个酶切位点在P53 CDS区的序列上不存在。按照限制性内切酶的使用说明书进行酶切反应，对克隆扩增回收的P53目的基因和pcDNA3.1载体进行NheI和XbaI双酶切，酶切完分别跑琼脂糖凝胶（根据目的片段大小选择合适的胶浓度），切胶回收，测浓度和纯度，进入产物连接环节。

三、目的基因和载体的连接，转化，克隆筛选

1. 载体：目的片段=1:3-1:10的比例，按T4 DNA连接酶的使用说明进行回收产物的连接操作，通常选择16℃过夜连接。

2. 连接产物直接转化感受态细胞DH5α（感受态细胞的选择要结合所用的载体，addgene官网提供载体所用的感受态信息），并涂布在含有Ampicillin 抗性的平板上，37℃过夜培养。

四、阳性克隆测序鉴定

挑选抗性平板上的阳性克隆（通常只有连接成功的克隆才能在抗性平板上生长），送测序，用M13通用引物测序鉴定。测序出来的序列信息与已知的序列信息比对，完全匹配的即为正确克隆。到这里我们就构建成了一个完整的质粒了。