【原】科研老司机的套路哲学（五）

作者：解螺旋.子非鱼

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导语

Ngage目前仍没有人重复出结果，所以现在的基因编辑还是要靠老司机CRISPR出马。今天就说说CRISPR的实验操作流程。

今年5月，韩春雨及其Ngago基因编辑技术火速刷屏了科研届的朋友圈，然而时隔两个月，因该技术的重复性差，使得韩教授再次走到风口浪尖。方舟子也借此发表了他的“高谈阔论”，一时间是非真相扑朔迷离。而近日，韩教授也全面公开了详细protocol以帮助其他人的重复实验工作，在此小鱼也真心期望这项技术的确真的切实有效。

 

既然说到DNA引导的基因编辑，就不得不提到其他的以RNA引导的基因编辑——CRISPR/Cas9。相比Ngago，CRISPR系统自横空出世后，便使其“前辈”—锌指核酸酶（ZNF）、TALEN技术乏人问津；且其强大编辑功能在历经千锤百炼之后仍在不断升级进化——目前为了实现更精准的基因编辑，已由日本科学家们完成了该系统进行单个碱基编辑的进化。

 

那么为了让广大的科研汪们体验一把上帝造物的感觉，小鱼就将CRISPR的实验操作流程分享给大家。

sgRNA设计

因CRISPR系统的靶点由19个碱基构成，靶点前面为转录起始信号G，靶点后面为PAM序列——NGG。因而在设计基因敲除时，可在基因的起始密码子（ATG）附近及下游查找GN20GG序列作为靶点。如果没有合适的序列，也选择N20GG序列作为靶点，构建载体时，人工加上一个G作为启动信号。

 

举个栗子，以人的MET基因（GeneID: 4233）为例，可选的靶点如下：

Note:1）一般建议构建2-3个靶点的基因敲除载体，再从中选出敲减效率较佳的靶点

2）Cas9Nicknase 需要挑选成对的靶点。一般在正义链和反义链上分别挑选相距20‐30bp 的靶点配对。

 

其次，需要设计识别靶位点的一对DNA oligos。将靶位点的23至250bp的外显子序列输入到以下在线设计的工具（1、麻省理工学院的CRISPR Design：http://crispr./；2、德国癌症研究中心的E-Crisp：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）的Input框中。而后，依据score的高低选取合适的Guide序列。根据酶切方式，选择合适接头，以Bbs1酶切为例：

 Note:a）合成的寡核苷酸质量对于能否成功构建载体至关重要，请务必委托值得信赖的公司进行合成。b）必须PAGE 纯化寡核苷酸。

构建表达sgRNA的Cas9质粒（以pGK1.1为例）

Oligo DNA退火反应：用水将合成后的2条单链oligoDNA稀释成100uM，按以下体系配制退火反应体系：

 

将上述体系瞬时离心后，置于PCR仪中，95℃孵育3min，自然冷却20min后，链接至载体中。

将连接产物转染DH5a高效感受态细胞，因pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需要测序验证序列的正确性。

转染靶细胞并进行阳性克隆筛选

转染前用去内毒素试剂盒进行质粒抽提，确保质粒浓度>=2ug/ul浓度。再取4-7ug进行转染靶细胞（贴壁细胞的数量为1×10⁶—3×10⁶，悬浮细胞数量为3×10⁶—5×10⁶）。如果细胞用脂质体转染困难，则推荐使用电转法。

 

然后，在转染48h或72h后提取细胞基因组DNA，用提前设计好的检测On-target或Off-target引物（上游引物在靶位点约100bp，下游引物在靶位点约200bp）对目的片段进行PCR扩增。

检测突变体及阳性克隆测序

1）测序评估

将PCR产物连接进T载体中，转化进DH5a细菌，随机挑取15-20个单菌落进行测序，评估目标片段被切割后碱基变化和切割效率。

单克隆测序比较

 

2）PAGE胶检测突变体

制备非变性PAGE胶，检测PCR产物，检测On-target或预测的Off-target sites位点（可选方法）。

 
PAGE胶检测突变体模式图

 

3）稀释法筛单克隆

如果选择的质粒中含有荧光标记，可用流式细胞术直接分选带有荧光的细胞；或者也可将转染的靶细胞从A1孔（细胞原液约1000个细胞/孔，数量根据细胞状态进行调整）至H1孔对半稀释，然后第一列再横向对半稀释，并用荧光显微镜观察细胞克隆生长情况，选择带有荧光的克隆，提取部分细胞的基因DNA进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳后将PCR产物直接送去测序。

至此，即可获得相应的基因敲除细胞。

 

此外，小鱼温馨提示，在做CRISPR实验之前，请您务必做好以下验证实验：

 

A、单细胞生长情况，确保单个细胞也可以正常生长形成单克隆，即低密度的细胞在培养皿中也可形成单克隆。

 

B、目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。