CRISPR/Cas9技术操作手册 | CRISPR

一、CRISPR/Cas9 基因敲除原理

  CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：

Cas9质粒构建

目前常见的CAS9普通质粒有：

虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（     lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast ），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达，但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，拖把等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果^[3,4]。接下来，我们主要介绍一下CAS9腺病毒包装流程。

二、实验流程

制备带有gRNA的caripr/cas9腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293FT细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

三、实验材料

该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括    ）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。其中穿梭质粒   和  能表达绿色荧光蛋白（GFP）。和 能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息（见附录）

2、细胞株  293FT，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株  大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

四、包装细胞293FT细胞的培养（参考293T细胞培养，见汉恒生物-腺病毒包装手册）

五、腺病毒包装、扩增和纯化

（一）质粒构建

1、gRNA设计

1、利用在线CRISPR设计工具(http://nome-engineering.org)设计靶向目的基因组的20 bp 长度guide sequences（引导序列）；或者，选择一个5-NGG上游的20 bp序列作为guide sequences（引导序列）。

2、合成在线CRISPR设计工具给出的相应的的寡核苷酸序列及引物。根据酶切位点设计相应的寡核苷酸序列及引物的如下：

A：若转染U6-sgRNA PCR 扩增产物：U6-Forword 引物不变，U6-Reverse 引物的5端则附加20-nt guide sequences 及sgRNA scaffold 序列（引物总长>100 bp）。如图：

B：若转染sgRNA表达质粒，则分别合成带有酶切位点剪切残基的guide sequences，退火后连入经BbsI 酶切的pSpCas9（BB）-GFP/puro载体骨架中。如图：

注意：20 nt的guide sequences 的末端可加一个C碱基（G-C碱基对）以促进U6启动子转录sgRNA的效率,oligo DNA 设计序列的第一个碱基必须是 G，如果你选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，可自行加一个 G 上 去。

2、sgRNA和Cas9共表达质粒的构建

（1）准备sgRNA寡核苷酸插入片段：分别重悬每条sgRNA链（步骤2B）至终浓度100uM。

（2）用连接酶进行磷酸化及退火

（3）将sgRNA 寡聚物克隆至pSpCas9（BB）载体中。

孵育连接反应总时间1 hr，孵育条件为：37度5min，21度5min。循环1-6次。

（4）核酸外切酶除去残留的线性化DNA

（5）转化。推荐Stbl3 感受态。

（6）挑选2-3个单克隆，摇菌，抽质粒，测序鉴定。

3、sgRNA有效性鉴定

   将sgRNA和CAS9共表达质粒转染目的细胞，两天后提基因组或者RNA，PCR，测序验证sgRNA是否有效，如测序结果的峰图有杂峰出现，或者测序结果比对时发现和原始序列比对时有缺失一段的序列，则可初步说明我们的gRNA是有效的，可以进行下一步病毒包装。

（二）病毒包装、扩增和纯化（详细步骤见汉恒生物-腺病毒包装手册）

（三）病毒感染细胞（详细步骤见汉恒生物-腺病毒包装手册）

（四）感染后观察

1、sgRNA敲除效果鉴定----连续稀释法分选单克隆细胞系

（1）将cas9/sgRNA腺病毒加入目的细胞培养基进行病毒感染。

（2）感染6h后进行换液，细胞继续培养24h用于后续单细胞分离鉴定。

（3）用细胞过滤器将细胞分离成单个细胞，计算每个24孔板中的细胞数目，连续稀释至0.5 cell/100ul，加入至96 孔板中。

（4）铺板大约一周后观察细胞克隆的外观，做好标记。继续孵育，扩增2-3周

（5）细胞长至60%以上融合度时，进行传代。移液枪上下吹动细胞20次，每个相应的克隆传一个孔，加20%的体积培养基。每2天更换培养液并视情况进行细胞传代。

（6）剩余80%体积的细胞，抽提基因组，鉴定目的基因序列，送测序进行基因型分析。

2、SURVEYOR 核酸酶实验检测插入缺失突变。此检测方法详见SURVEYOR应用文件。

（1）感染目的细胞、将cas9/sgRNA腺病毒加入目的细胞培养基进行病毒感染。

（2）感染后换液。感染6h后进行换液，细胞继续培养24h用于后续DNA提取和基因型分析。

（3）基因组抽提。对感染病毒后的细胞进行基因组抽提，基因组抽提步骤见具体试剂盒说明书。

（4）调取目的基因。对目的基因进行引物设计，用于PCR调取目的基因序列。

（5）PCR-SSCP分析。取5μL PCR 扩增产物，与10μL上样缓冲液( 98% 甲酰胺 0. 025% 二甲苯氰 2% 甘油0.01 mmol L－1EDTA) 混合，瞬时离心后放于PCR 仪中99℃变性 10 min， 并立即置于冰上， 冰浴30 min 后上样于 15% 非变性聚丙烯酰胺凝胶,4℃,180 V,200 mA条件下电泳12～15 h电泳结束后取胶进行银染显带,判定基因型根据电泳图谱鉴定基因型,并按基因型选取 3～5个个体的 PCR 产物,经纯化回收后送测序。

(6) 数据分析。利用 Mutation Surveyor软件对基因进行突变分析。

3、利用RFLP分析 HDR-介导的靶向修饰的基因型。此检测参照RFLP原理

（1）感染目的细胞、将cas9/sgRNA腺病毒加入目的细胞培养基进行病毒感染。

（2）感染后换液。感染6h后进行换液，细胞继续培养24h用于后续DNA提取和基因型分析。

（3）基因组抽提。对感染病毒后的细胞进行基因组抽提，基因组抽提步骤见具体试剂盒说明书。

（4）调取目的基因。对目的基因进行引物设计，用于PCR调取目的基因序列。

 (5) 获取RFLP酶切片段。对获取的PCR产物电泳后纯化胶回收。用不同的限制性内切酶对PCR产物进行随机引物PCR，然后电泳分析获得不同酶切特征的片段。

（6）测序分析。对获取的不同酶切特征的片段进行胶回收后测序分析特定的突变类型。

六、动物实验[5]（见汉恒生物病毒动物实验资料）

七、参考文献

[1] Patrick D. Hsu,1,2,3 Eric S. Lander,1 and Feng Zhang1,2. Cell 157, June 5, 2014. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering.

[2] Krzysztof Chylinski1,2, Kira S. Makarova3, Emmanuelle Charpentier1,4,5 and Eugene V. Koonin. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42, No. 10.Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems

[3] 方锐 畅 飞 孙照霖 李宁 孟庆勇. Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702. CRISPR/Cas9 介导的基因组定点编辑技术

[4] Melissa M. Harrison, Brian V. Jenkins, Kate M. O'Connor-Giles, et al. Genes Dev.2014 28: 1859-1872. A CRISPR view of development.

[5] gnazio Maggio*, Maarten Holkers*, Jin Liu, Josephine M.Janssen, Xiaoyu Chen & Manuel A. F. V. Gonçalves. SCIENTIFIC REPORTS | 4 : 5105 | DOI: 10.1038/srep05105. Adenoviral vector delivery of RNA-guided CRISPR/Cas9 nucleasecomplexes induces targeted mutagenesisin a diverse array of human cells