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CN 103668472 A Abstract 本发明提供一种利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法，先将编码Cas9和OCT1蛋白的基因表达于真核细胞系中，筛选获得稳定表达Cas9的细胞系，再进行文库构建和功能筛选。其最大的优点在于：可将此方法应用于绝大多数真核细胞系中，不受特定细胞系的限制。另外，进行功能性筛选阳性率高，背景值低。大规模的筛选方法极大降低了成本，克服了单个制备基因敲除细胞，所导致的时间和劳动成本高的问题。
Claims(6) 1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)构建稳定表达OCTl蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系:将编码蛋白OCTl和Cas9的DNA序列通过柔性Linker连接，然后克隆至慢病毒载体p0CTl-2A-Cas9-1RES-BSD上；用构建好的载体转染真核宿主细胞；筛选稳定表达OCTl蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系；其中，载体p0CTl-2A-Cas9-1RES-BSD 的序列如 SEQ ID N0.1 所示； 2) SgRNA质粒文库的构建: 1.根据SgRNA作用位点的DNA序列5，-G-Nx-NGG-3，，其中19 ^ x ^ 22,设计并合成针对上述作用位点的SgRNA单体,针对同一个SgRNA作用位点设计两个SgRNA单体,其序列分别为正向单体:5’ -ACCG-Nx-3’，反向单体:5’ -AAAC-N’ x_3’，其中N’ x为Nx的反向互补序列，N和N’表不喊基A、T、G或C ; i1.将上述合成的针对同一个sgRNA作用位点的两个SgRNA单体退火形成具有粘性末端的双链DNA，并将针对所有基因合成的sgRNA单体经退火形成的双链DNA等量混合； ii1.将人U6启动子连接ccdB序列以及序列5’ -G-Nx-NGG-3’之后，连入PLL3.7载体中替换原载体上的U6启动子，将构建好的载体与ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性内切酶和T4连接酶，37°C 5min, 16°C 5min，重复10个循环； iv.将上述产物转化至Transl-Tl感受态细胞中,提取质粒，即构建得到sgRNA质粒文库； 3)将上述质粒文库中的质粒与质粒psPAX`2和PMD2.G共转染至HEK293T细胞中，培养细胞，收获病毒液； 4)用收获的病毒液按MOI=0.05接种步骤I)中构建得到的真核细胞系，细胞经培养后，使用流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞，即获得真核基因敲除的细胞文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述真核宿主细胞包括但不限于 HEK293T、HT1080、HeLa 细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中所述柔性Linker序列为p2A:5' -GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT-3'。
4.根据权利要求1-3任一项所述方法构建的真核基因敲除细胞文库。
5.一种研究基因功能的方法，其特征在于，基于权利要求4所述的细胞文库，提取细胞的基因组DNA，设计引物，PCR扩增含有sgRNA序列的DNA片段，利用深度测序技术对扩增产物进行测序，分析测序结果，从而确定sgRNA所对应基因的功能。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物序列为正向引物:5’ -TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC-3’，反向引物:5’ -AATACGGTTATCCACGCGGC-3’。
Description 利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法 |
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来自： CanevaeCollect > 《CRISPR》
