干货满满——CRISPR文库，从入门到进阶

上图展示今年以来CRISPR文库相关IF>20的文章列表的1/4。 这两年，CRISPR/CAS9火到让人习以为常。

利用其多方面的潜能，各种工具被开发出来，给科研工作者在生物体各个层面涂涂改改做研究提供了极大便利。简单列举如下表：

● DNA水平，可以实现精确基因编辑，大片段、单碱基都能hold住！

● RNA水平，转录调控RNA上下调，RNA干扰全都搞的定！

● 表观遗传水平，调控DNA碱基甲基化不是梦！

● 还有分子定位， 基因检测(SHERLOCK) 等等等等

更关键的是，这些工具不仅可以对单分子进行操作，更强大到可以在组学水平进行全面筛选——那就是CRISPR相关文库。

今天小编尝试由浅入深，跟大家聊聊CRISPR文库。

一 首先，CRISPR/CAS9系统如何发挥作用？

第一步：引发双链DNA断裂（DSB）

简单来说，CRISPR/CAS9系统是蛋白-RNA复合体(RNP)，两者结合，一起发挥功能：

● sgRNA，通过与DNA碱基互补配对将RNP定位于基因组

● Cas9，核酸内切酶，切割DNA双链诱发DSB（红色箭头）

至此，CRISPR/CAS9系统的使命——瞄准了，切两刀，结束。

第二步：利用细胞DSB修复机制——编辑基因组

CRISPR/CAS9造成一个DSB，而真正帮助我们实现目的的，其实是细胞本身的DNA修复机制： 

● 无模板，非同源介导的基因编辑（NHEJ)，不精确，引发移码突变，实现基因敲除（KO，Loss of Function)

● 有模板，同源介导的基因修复（HDR），精确编辑

一点点补充：

● 有很多CRISPR系统只需要瞄准了，即精确结合到DNA（或RNA）上；

● 不需要切两刀，即通过点突变将CAS9的2个核酸内切酶相关功能域失活；

● 通过与CAS9融合表达另外一个功能蛋白（心有多大，舞台就有多大），实现其他功能，简单列举如下： 

附：SAM/Sun-tag/CRISPRa

下面我们以CRISPR/CAS9本体用于基因功能研究为例接着聊。

二 CRISPR/CAS9介导的基因敲除——强大的Loss of Function功能研究工具

说起Loss of function，必提RNA干扰。那么，比一比？

● RNA干扰残留目的基因仍旧可能维持其功能（图左）

● CRISPR/CAS9可将基因完全消除进而揭示其功能（图右）

三 如何用这一强大工具进行组学层面的基因筛选呢？

先看流程

● 如果CAS9和sgRNA通过两个载体导入细胞，那么需要就叫做“双载体”系统，看左边。

● 如果CAS9和sgRNA通过一个载体导入细胞，那么需要就叫做“单载体”系统，看右边。

筛选原理？

主要原因是利用了慢病毒整合基因组的特性，以单载体文库说明：

一定用慢病毒？

除了整合的特性，慢病毒还有如下特点，让你不得不爱：

用RNAi文库也可以进行Loss of Function筛选啊？

那我们对比一下RNAi和CRISPR/CAS9如下：

针对同一基因多靶点表型一致性这一关键数据，来源是Science：

所以，CRISPR/CAS9可能更有优势哦~

做好CRISPR/CAS9文库筛选实验的关键是什么呢？

结合流程，细胞感染、药筛、收取细胞进行NGS都算是比较常规的操作，关键在：

CRISPR/CAS9文库过关！具体来说：

1. 针对靶基因设计sgRNA科学合理。

a. 特异性要高，脱靶率要低，活性还要高。

b. 尽量选择多个转录本的共有外显子。

2. 单个基因要有多sgRNA对应。

a. 虽然张峰库靶点有效率平均高达80%（见下图），但还是需要多靶点设计保证针对每个基因都有有效靶点。

b. 若基因敲除后有功能，多靶点可以互相印证，避免脱靶带来的假阳性

3. 文库质粒构建和扩增必须经质检达标。

像张锋的human GECKO文库，大概有12万+条sgRNA，经过质粒构建、质粒扩增，必须经过NGS测序确保达到以下的高标准： 

a. 左图，高覆盖率。质粒扩增后经NGS，测到的sgRNA覆盖率要争取向“24K”的标准看齐——99.99%。

b. 右图，高均一度。不同sgRNA靶点含量差距不能太大。

4. 病毒包装

在文库筛选过程中，我们期望除了药物，其他刺激的影响越小越好。所以病毒必须高滴度、高纯度、无污染：

更重要的是，慢病毒文库也必须有向24K看齐的高覆盖率和高均一度。 下面是慢病毒感染细胞后抽取基因组NGS的慢病毒文库质检结果。

OK，经过两轮NGS测序，我才拿到了可以放心实验的CRISPR慢病毒文库。

前面虽然说简单说说，现在也还越发觉得不简单。反正我是觉得，如果让我自己做个慢病毒文库，简直跟读了半个博一样。

科研需要CRISPR慢病毒文库怎么办？

现在来说说我的老东家吧，下面是广告~

前面这些硬货干货，都是我在老东家耳濡目染接触到的，

数据也都是同事实打实一枪一枪、一盘一盘、一lane一lane做出来的，

为了做好CRISPR文库，

他们可谓是匆匆忙忙、没白没黑、试了又试，

最近看到他们躁动在周围蹦来跳去、时不时还亢奋的喊：

我们要成为国内CRISPR文库NO.1的专家！

不管是从头开始定制一个文库还是要张锋的现货文库，

不管是基因敲除文库还是SAM过表达文库，

不管是人、小鼠、大鼠还是猪牛羊、河豚或草泥马，

我们都肯定是速度最快、质量最好、性价比最高、服务最优！

看到他们的状态，我是信了。

各位看官信或者信，都可以扫下面的二维码看看，

趁他们疯之前！